细胞凋亡及检测方法详解.ppt

细胞凋亡及凋亡检测 2011-2-25 一、概述 细胞凋亡(apoptosis)：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞死亡） 1972年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。“凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样 研究简史 半个世纪前:人们就观察到生理自发退化死亡现象. 1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程 1972年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念 1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。 1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等 1989年: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。 1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因 细胞死亡的形式 坏死：活体组织细胞的死亡 凋亡 细胞凋亡与坏死的比较 细胞凋亡的生理病理意义 ①确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞） ②维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞 ③发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，阻止病毒复制 二、细胞凋亡的过程 细胞凋亡的大致过程： 凋亡信号转导 凋亡基因激活 细胞凋亡的执行 凋亡细胞的清除 凋亡的四个阶段： 三、凋亡时细胞的主要变化 （二）细胞凋亡的生化改变 2. 内源性核酸内切酶激活及其作用：内源性核酸内切酶在核小体连接部切断DNA双链。 凋亡诱导因素→细胞内信号转导 无活性内源性核酸内切酶 活性内源性核酸内切酶 →核小体连接部切断DNA双链→电泳呈特征性的“梯状”条带 3. Caspase的激活及其作用 Caspase（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶 主要作用： ①灭活细胞凋亡抑制物（Bcl-2） ②水解蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体 ③水解级联反应相关活性蛋白，使之获得或丧失某种生物学功能 Caspase的作用 Caspase 的特点 3.Caspase触发凋亡途径 细胞外途径：细胞表面死亡受体途径 细胞内途径：线粒体引发途径 内质网介导的凋亡通路 细胞外途径 细胞死亡信号蛋白结合细胞表面相应受体，死亡受体与配体结合，导致死亡结构域聚集，使死亡受体分子活化； Caspase-8活化：Caspase酶原在局部聚集，FADD与procaspase-8的DED结合形成信号复合物， procaspase-8水解活化形成有活性的caspase-8； 细胞凋亡： 激活的caspase-8激活下游的caspase引起细胞凋亡 细胞内途径 是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径； 过程：凋亡刺激——死亡促进因子，包括细胞色素C、凋亡诱导因子、促死亡蛋白、Caspase酶原释放——Caspase活化——细胞凋亡 内质网介导的凋亡通路 内质网钙离子内环境紊乱及过量内质网蛋白积累激活Caspase-12； 同时胞质中的Caspase-7移入内质网，进一步激活 Caspase-12； 激活的Caspase-12可进一步剪切Caspase-3，细胞凋亡 （三）细胞凋亡的调控 （2）抑制性因素 2. 细胞凋亡信号转导 研究较多的系统： 2．cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使） 3．Fas蛋白/Fas配体信号系统 4．神经酰胺信号系统 五、细胞凋亡检测 形态学观察方法 DNA凝胶电泳 酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 流式细胞仪定量分析 Western blot检测 （一）形态学观察方法 HE染色：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象 2.丫啶橙（AO) 染色 AO透过胞膜完整的细胞，崁入细胞核DNA，发绿色荧光； 活细胞核呈绿色荧光； 凋亡细胞染色增强，核染色质呈黄绿色或橘红色，浓聚在核膜内侧（核固缩），可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体； 坏死细胞：核染色质橘红色 3. 台盼蓝染色 如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死细胞。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡