四重组DNA技术分析报告.ppt

第四节 重组DNA技术 目 录 一、目的基因的克隆 二、重组体的筛选 三、DNA的人工合成和扩增 四、基因的定位诱变 一、目的基因的克隆 DAN克隆，又称重组DNA，是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA，与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DAN分子。 实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称重组DNA技术，又称基因工程。 一个完整的DNA克隆过程包括： 目的基因的分离 载体的选择与酶切 目的基因与载体的连接 通过转化或转染将重组DNA分子导入受体细胞 筛选转化子或转染子并鉴定携有特定DNA片段的转化子 一、目的基因的克隆 （一）目的基因的分离 从组织或细胞中分离染色体DNA，利用限制性核酸内切酶（如BamHI,EcoRI）将染色体DNA切割成许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。 限制性核酸内切酶能识别双链DNA上4~6个核苷酸序列，并切开两条单链上的磷酸二酯键。 如果在识别位点进行不对称切割，则酶解后的DNA具有互补的、单链突出末端，即粘性末端；如果对称切割则产生平端的片段。 （二）载体的选择 外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连接到载体上，外源DNA则可作为载体的一部分在受体细胞中复制。 载体主要有：质粒、λ噬菌体 区别：质粒载体的容量比λ噬菌体载体小。 克隆载体基本要求和特性： 是一个复制单位，在受体细胞内具有DNA独立复制的能力。 相对分子质量尽可能的小，容易从细胞中分离纯化，便于离体条件下的操作。 包含有多种限制性内切酶的单一切点，在切点内可以与外源DNA重组。 载体分子内有不影响其复制、生长的非必要区域，在此区域内插入外来DNA片段，仍可与载体一起复制、扩增。 具有多种选择性标记，常用营养缺陷型、抗药性、形成噬菌斑的能力和外源性蛋白质的产生等，作为区分转化、重组与非重组的指示。 （三）外源基因与载体的连接 如果载体DNA和供体DNA都采用相同的限制性内切酶切割，则两种线性DNA分子就会有相应互补的粘性末端。当这两种线性DNA分子在较低温度下混合在一起时，粘性末端上碱基互补的片段可以重新建立起氢键联结，称为“退火”。这时，在DNA连接酶的作用下，可以“缝合”供体DNA和质粒DNA片段的裂口，形成完整的具有复制能力的环状“重组质粒”。 （四）重组DNA导入受体菌 一般以大肠杆菌K-12改造菌株为受体菌，如大肠杆菌JM107、JM109、HB101等。利用转化方法可以将连接在质粒载体上的外源基因导入受体菌细胞内。 如果载体是噬菌体，则重组DNA以感染的方式而进入受体细胞中。 二、重组体的筛选 通过转化或感染，重组体DNA分子被导入受体细胞，经培养得到大量转化子菌落或噬菌斑。如何从众多的转化子菌落或噬菌斑中筛选并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程即为筛选。 根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取不同的选择方法。 （一）原位杂交 把含有重组DNA的转化子菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，用碱处理膜上的菌落或噬菌斑，使细胞裂解，DNA变性成为单链，带变性DNA固定在滤膜上以后，洗去细胞碎屑。用32P标记的特异性DNA探针杂交，通过放射性自显影找出与探针杂交的菌落或噬菌斑。该菌落或噬菌斑的细胞中所含的重组DNA上便携带有目的基因。 （二）原位放射免疫法 当克隆的基因编码某种已知的蛋白质时，就能利用放射免疫法进行检测。这种检测法首先必须取得该基因产物的特异性抗体。然后利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用的原理来筛选重组体。 （三）遗传学方法 利用适当的突变性作为转化的受体，可直接筛选出携带目的基因的重组质粒。例如，受体菌大肠杆菌是某一氨基酸缺陷型，在缺乏这种氨基酸的培养基上不能生长，如果将携带有来自某低等真核细胞染色体DNA片段的重组质粒转化进该受体菌后，该受体菌能在缺乏这种氨基酸的培养基上生长，就可以初步判断该重组质粒是携带有编码此氨基酸的酶基因。 三、DNA的人工合成和扩增 （一）DNA的人工合成 DNA的合成是一个固相过程，第一个核苷酸固定于不溶的固体多孔支持物上（如带有50um颗粒的硅胶）。在固相合成中，头一个脱氧核苷酸是通过它的3’ –OH基团直接附着在惰性的固相载体上。这种载体同样也起到一种3’ –末端保护装置的作用。在实际合成过程中，固相载体（如硅胶）是被装填在一种烧结玻璃柱内。试剂只是在规定时间内才允许同末端脱氧核苷酸进行连接反应，并且每次只接长一个核苷酸。在进行下一次的连接之前，要用适当的溶