应用聚合酶链反应检测的副溶血性弧菌与热带海产品和沿海环境的相关性译文重点解读.doc

应用聚合酶链反应检测的副溶血性V. Dileep1, H.S. Kumar1, Y. Kumar1, M. Nishibuchi2, Indrani Karunasagar1 and Iddya Karunasagar1 1渔业微生物部门、农业科学大学、渔业大学, 印度芒格洛尔- 575002； 2东南亚研究中心、日本京都大学 2002/315:收稿于2002年10月17日,修改于2003年2月11日,接受于2003年2月20日 摘要 V. Dileep, H.S. Kumar, Y. Kumar, M. Nishibuchi, Indrani Karunasagar and Iddya Karunasagar 目的: 通过分子技术与传统的微生物学方法研究海产品、水和沉积物中的副溶血性弧菌存在率。方法和结果:对86个样本进行分析, 使用传统微生物方法分析有28个样本为副溶血性弧菌阳性,然而采用以toxR为目标片段的 PCR测量结果为58个样本为阳性，直接表现为增菌液浑浊。一个贝类软体动物样品为tdh基因阳性,在贝类软体动物三倍增菌液中检测出trh基因。结论:直接将PCR运用到增菌液能够更加快速和敏感地检测出海产品中潜在的副溶血性弧菌。意义和影响研究:副溶血性弧菌是一种重要的人类病原体，它引起的食源性肠胃炎在全球范围内流行。因为副溶血性致病性菌株和非致病性菌株广泛存在于海产品中,针对特殊的毒力基因(tdh trh)的PCR的应用将有助于副溶血性致病性菌株的检出从而减少食源性疾病的风险。 关键词:聚合酶链反应、海产品、tdh、trh、副溶血性弧菌 介绍 副溶血性弧菌广泛分布在全世界海岸和河口水域。自1950年首次报告(Fujino等，1953)，这一菌株就被认为是肠胃炎的病原体。最近随着O3:K6副溶血性弧菌株引起急性胃肠炎的流行，这个依靠海产品传播的病原体被认为(松本等，2000)具有重要意义。Miyamoto等(1969)、Thompsonand 和Vanderzant (1976)指出, 与胃肠炎有关的副溶血性弧菌的菌株在名为我氏妻琼脂(Wagatsuma 1968)的高盐血琼脂上产生的B溶血环，然而环境中的副溶血性弧菌只有1 - 2%才有这种溶血现象。这种现象被称为神奈川现象,它是由耐热直接溶血素(TDH)引起的,因而TDH被视为副溶血性弧菌的主要毒力因子(Nishibuchi和Kaper，1985)。对神奈川现象阴性的临床菌株进行研究，发现了与TDH相关溶血素 (TRH),这也被认为是副溶血性弧菌的一个重要毒力因子(Honda、Miwatani，1988; Honda等 ，1990)。尽管生产TDH可以用于测试Wagatsuma琼脂或商用免疫学设备,但这些测试繁琐且费时。目前,并没有血琼脂培养基和商用免疫设备能够检测副溶血性弧菌产生的TRH。 因为只有一小部分的环境毒性菌株,为了保证海产品的安全,海产品中毒性菌株的检测尤其重要。TDH和TRH是分别由tdh和trh基因编码,菌株不能产生这些溶血素是因为缺乏了其对应的基因(Nishibuchi和Kaper,1995)。聚合酶链反应(PCR)检测这些基因是否存在的方法已经建立起来了(Tada等，1992；Lee和Pan,1993;Karunasagar等，1996)。分子流行病学研究已经说明了菌株携带tdh基因、trh基因或者携带两个基因的的临床意义 (Nishibuchi等，1985；Shirai等，1990；Kishishita等，1992)。此外,副溶血性菌株具备调节基因toxR,无论是否有能力产生TDH或TRH的菌株都存在这种基因(Kim等，1999年)。因此,用PCR方法检测toxR基因，可以作为一种菌种识别方法 (Kim等，1999)。 本研究的目的是评估针对tdh,trh和toxR基因的PCR方法是否能够直接应用于浓缩的培养基配，来检测这一重要的以海产品为传播媒介的病原体。研究比较了PCR方法和传统的微生物学方法，使用以toxR基因目的片段的PCR方法对印度环境中的生化非典型菌株的进行了分离并评估了其效果。 材料和方法 样本 样品从印度芒格洛尔的水产登陆中心、鱼市场和各种河口获得，包括虾、螃蟹、软体动物和鱼类,以及从排放入海的污水中收集的水和沉积物样品。样本收集时间为2001年1月至5月。样本收集处理时间为1小时内。 副溶血性弧菌样品的处理,浓缩和分离 方法参照食品和药物管理局颁布的方法(FDA 1992)，有一点轻微的修改。简单地说,即25克或25 ml样品中加入225毫升碱性蛋白胨水(APW HiMedia,孟买,印度)，再进行一系列的10倍稀释，接种于TCBS平板 (HiMedia,孟买,印度)。在37℃下培养6h后将增菌液接种于TCBS平板进行传代培养。