EMSA试剂盒使用方法技术分析.docVIP

基因结构和功能系列 CAT#:131039-100 低温运输保存 即用型EMSA试剂盒 Electrophoretic Mobility Shift Assay Kit 使用手册V1.0 产品及特点 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay），也称gel shift，是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。其原理如下： 本产品具有下列特点： 一站式，使用方便，本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样液等主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。 非特异性结合低，EMSA结合缓冲液中含有poly(dI-dC)等有效成分，其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。 用户需自备待标记的EMSA探针、用于探针标记的同位素、EMSA胶配制的相关试剂。 本试剂盒足够标记10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。 规格及成分 成份 T4 Polynucleotide Kinase 131039A 100 U T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×) 131039B 100 μL Nuclease-Free Water 131039C 1 mL 探针标记终止液 131039D 100 μL 5M 醋酸铵 131039E 600 μL EMSA结合缓冲液(5×) 131039F 200 μL EMSA上样液(蓝色，10×) 131039G 200 μL EMSA上样液(无色，10×) 131039H 200 μL TE溶液 131039I 2 mL 使用手册 1份 一、探针的标记： 探针标记的反应体系如下： 成 份 用量 待标记探针(1.75pmol/μL) 2 μL T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10×) 1 μL Nuclease-Free Water 5 μL [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/mL) 1 μL T4 Polynucleotide Kinase(5-10u/μL) 1 μL 总体积 10 μL 按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。 37℃反应10分钟。 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 探针的纯化： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作： 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积（即25微升)的5M醋酸铵，再加入2倍体积（即200微升）的无水乙醇，混匀。 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。 在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 EMSA胶的配制 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。 成 份 用量 TBE buffer(10×) 1 mL 重蒸水 16.2 mL 39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v) 2 mL 80% 甘油 625 μL 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) 150 μL TEMED μL 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气