基因工程6概述.ppt

原位杂交包括取材及材料预处理、固定细胞、细胞的RNase酶解及染色体变性、杂交、检出五个程序。探针的制备与印迹杂交相同。在取材及材料处理上，因要观察的是细胞内的染色体，有丝分裂中期的染色体。取材时应取便于观察染色体的材料，如植物的根尖、茎尖、幼叶、幼小的子叶、茎形成层、居间分生组织、愈伤组织、花蕾、花粉、胚乳等，还要用化学或物理的方法对材料进行预处理，阻断纺锤体微管的形成，使有丝分裂停滞于中期，这样可以得到大量的供实验用的染色体。 目前原位杂交技术存在两个问题： 一是灵敏性不高。 二是有时会出现非特异性杂交。 PCR-Southern杂交是一种近年来开始使用的检测外源基因整合的方法。该方法先对被检材料进行外源基因的PCR扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。 5 PCR-Southern杂交检测 1）转基因植株PCR—Southern杂交检测 （1）样品设置 为确保检测的真实性，除被检样品外，实验中应设置三个对照： ①空白对照：无任何DNA模板(反应体系中不加入任何模板DNA，其它试剂相同，主要检测反应体系中有无DNA污染)。 ②阳性对照：以外源基因的质粒载体DNA为模板。 ③阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。 ④被检样品：以不同克隆系的基因组DNA为模板。 （3）印迹及杂交 将扩增产物电泳后的凝胶碱变性处理后转移到固相膜上，以