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第二章 生物制药工艺技术基础Basis of biopharmaceutical technology  一、生物材料的选择： 1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质 2．生物材料的采集与质控(P38) （1）品种鉴定； （2）防止污染与感染； （3）选择富集目的物材料； （4）冷冻保存 二、生物活性物质物质常用的提取方法与优化 1.溶剂选择 2.选择添加剂 ①保护剂； ②酶抑制剂 3.提取条件 ①温度； ②pH； ③盐； ④表面活性剂 三．浓缩与干燥 2. 干 燥 ①低温真空干燥； ②喷雾干燥； ③冷冻干燥 四、分离纯化 1. 生化制药工艺中分离纯化特点: (1) 生物材料组成复杂 (2) 目的物含量低 (3) 易变性、失活 (4) 分离方法有很大经验成分 (5) 步骤多，逐级分离 (6) 产品验证与化学上纯度概念不完全相同 2. 分离纯化原理： (1)根据分子形状与分子大小 (2)根据电荷差异 (3)根据分子极性与溶解度大小 (4) 根据吸附特性 (5) 根据生物配基特性 3. 选择原则 （1）粗品分离：大处理量，相对低分辨率 盐析，分级沉淀，萃取，超滤 （2）精制：高分辨率 多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦 第二节 微生物制药工艺技术基础 一、菌种的选育与保藏 1．自然选育 依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。 方法： （1）平板划线法 （2）稀释平板法 2．诱变育种 （1）出发菌株的选择 ①稳定性； ②具备某种优良性状的菌株； ③对诱变剂敏感；④生理状态及生长时间 （2）诱变处理 ①化学诱变； ②物理诱变； ③生物诱变 （3）筛选： ①随机筛选； ②半理性化筛选 突变株筛选流程 突变株筛选流程 3、现代菌种选育技术 ① 杂交育种 ② 原生质体融合 ③ 基因工程技术 3．菌种保存 （1）保存目的：防止退化 （2）菌种退化检查方法 （3）菌种退化防止方法 ①防止基因突变：如低温保藏 ②采用双重缺陷型 ③制作平行的菌种斜面，少传代 ④分离单菌落，自然筛选 ⑤选择培养条件 （4）菌种保藏方法： ①斜面低温保存 ②液体石蜡封藏法 ③甘油冷冻法 ④冷冻干燥法 ⑤液氮保藏法 二、发酵工程技术基础 图1 L-Lys生产过程工艺设备图 第三节 生物技术药物制造技术基础 2．基因工程药物制造过程 二、基因工程主要操作技术 1．目的基因的获得 （1）cDNA文库 纯化目的mRNA，逆转录成cDNA ① mRNA的分离 ② cDNA第一链的合成 ③ cDNA第二链的合成 ④ cDNA与载体连接 ⑤ 转染或转化 ⑥ 筛选目的克隆 目的基因的获得：cDNA文库 （2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR） 典型PCR反应包括： ①模板变性 94℃以上(1～2’) ②退 火 50～55℃(1～2’) ③延 伸 72℃ (1～2’) 在高温聚合酶作用下，以DNA单链 为模板，由引物起始从5’→3’延伸。 （3）化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。 2．DNA重组体的构建 根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector） （1）E.coli质粒非表达型 pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。 （2）芽孢杆菌 pUB110 pE194和pC194 （3）链 霉 菌 pIJ101 pSG5 cDNA与载体连接方法： ①同聚尾连接法 ②人工接头连接法 3．重组体的表达系统 （1）原核表达系统 ①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性 （2）真核表达