2013环微实训0624.docVIP

实验四 土壤中微生物总DNA的提取 一、实验目的 1、熟悉从土壤中分离提取微生物总DNA的原理 2、掌握从土壤中提取微生物总DNA的方法 3、了解凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电泳的使用方法 二、实验原理 土壤是微生物最大的栖息地，20世纪80年代，微生物学家采用免培养(culture-in-dependent)方法，即直接从土壤中提取微生物总DNA的技术，使得在基因水平研究这些未培养微生物的存在、群落结构和功能等情况成为可能。从环境样品中直接提取和纯化微生物总DNA是在分子水平上研究未培养微生物基因资源的关键。从环境样品中提取核酸通常有两种方法：直接裂解法(也称为原位裂解法)和间接裂解法(也称为异位裂解法)。直接裂解法是先在原位将细胞裂解后直接从土壤样品中提取DNA。间接裂解法是先把细菌细胞和土壤颗粒分开，然后裂解细胞，提取DNA，最后进行纯化。就DNA产量、分子操作所需要的DNA纯度和微生物多样性的代表性而言，两种方法各有优缺点。TENP缓冲液：50 mM Tris，20 mM EDTA，100mM NaCl，1% PVPP交联聚乙烯吡咯烷酮，pH10 PBS缓冲液：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2?HPO4，2 mM KH2?PO4?，pH7.4 DNA提取缓冲液： TrisBase 0.1M, EDTA 0.1M, NaCl 1.5M, CTAB 1% 溶菌酶（10 mg/ml） 蛋白酶K(20 mg/ml) SDS (20%，m/V) 氯仿：异戊醇（24：1）?取1 g土壤，加入6 ml TENP缓冲液，涡旋震荡混匀10 min，12000 rpm离心5 min，弃上清，重复洗涤3次； 土壤沉淀再加入6 ml PBS缓冲液，洗涤一次，弃上清； 加入.75 ml DNA提取缓冲液，再加入 μL溶菌酶，μL蛋白酶K，水平摇床上225 rpm，37 摇动30 min； 再加入 ml SDS，65 水浴 h，其间间隔0 min混匀一次； 6000 g室温离心15 min，上清液转入新的离心管中； 分别加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀，6000 g离心15 min，取上清，重复抽提一次；加入体积的异丙醇，室温放置1 h； 12000 rpm室温离心20 min，沉淀用μL 70%乙醇清洗2次，风干； 用0μL无菌去离子水重新悬浮。μL DNA溶液，在1% （w/v）琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA提取效果。（使用DNAmarker 作为判断DNA大小的标准） 五、思考 比较实验指导书上方法和本方法的异同。 实验五、微生物总DNA 中16S rDNA 的PCR 扩增 1、掌握PCR 扩增的基本原理、方法和步骤； 2、了解PCR扩增仪的使用方法；进一步熟悉凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电泳的使用方法。 二、实验原理 PCR(polymerase chain reaction) 是一种选择性体外扩增DNA 的方法，它包 括三个基本步骤：(1)变形(denature)使目的双链DNA片段在高温下(一般为95 ℃) 解链，分离出单链的模板；(2)退火(annealing)使两种寡核苷酸引物在适当温度下 (55 ℃左右)与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(extension)使DNA 聚合 酶在最适温度下(72 ℃)下以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核 苷三磷酸(dNTPS)合成新生的互补链，并从引物的结合端开始，按5‘→ 3’方向延伸。上述三个基本步骤称为一轮循环，理论上重复25~30 轮这样的循环，就可以使目的DNA 扩增至106 倍。 三、实验材料 1、样品：土壤总DNA； 2、仪器及相关用品：PCR 扩增仪，电泳槽及核酸电泳仪，凝胶成像系统， 移液枪及吸头，0.5 ml PCR 管，台式高速离心机。 3、试剂：Taq DNA 聚合酶，10′PCR 反应缓冲液，MgCl2 25 mmol/L，四种 dNTP 混合物各为2.5 mmol/L；引物：正向引物和反向引物浓度为25 pmol/L，灭菌的去离子水(ddH2O)；微生物总DNA模版 ，用灭菌的去离子水稀释10 倍后用作模板进行PCR 扩增；DNA 分子量标准，1.0 %琼脂糖，核酸上样缓冲液。 4、引物： 上游引物：5- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCG CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG -3‘； 下游引物：：5- ATTACC GCG GCT GCT GG-3’。 1、建立 PCR 扩增反应体系 PCR 扩增反应体系总体积为50，向PCR 反应管中依次加入以下试剂： 10×PCR 缓冲液 5 μL dNT