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土壤淀粉酶产生菌的筛选、分离纯化与活力测定201306230406 冯夏艳 浙江工业大学 生环学院生技1302班 摘 要: 【目的】了解与掌握土壤淀粉酶产生菌的分离纯化、筛选、活力测定与生理生化反应测定。【方法】从土壤中分离产淀粉酶的微生物，对初步筛选到的淀粉酶产生菌进行复筛，对其进行摇瓶好氧培养，并用透明圈法测定微生物淀粉酶活性，最后进行简单的生理生化反应测定。【结果】经筛选并培养后的土壤淀粉酶产生菌有一定的活性，可根据淀粉酶透明圈的大小来判定，而且可通过简单的生理生化反应测定其基本性质。【结论】通过土壤中淀粉酶产生菌的筛选，淀粉酶产生菌的分离纯化及产淀粉酶的摇瓶发酵培养，一步步分离纯化，从而获得了纯化程度极高的淀粉酶产生菌，并根据标准曲线测出了酶活力的大小。 并通过细菌鉴定中的生理生化反应来了解细菌生理代谢情况，试验了细菌分解糖类物质产酸产气的情况，并用V.P试验和M.R试验检测的该菌呈阳性。 关键词: 土壤淀粉酶，划线分离，透明圈法，生理生化反应 1 材料与方法 材料 1.1.1土壤淀粉酶产生菌的分离 土壤样品;培养基及试剂:牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、PDA培养基、99ml无菌水1瓶（带玻璃珠）、6支9ml无菌水试管等;仪器及用具：无菌培养皿、无菌吸管、无菌水，酒精灯、无菌涂布棒（又名扩散棒、三角棒）、接种环、生物洁净工作台、生化培养箱、人工智能培养箱、手动菌落计数器（sc6）、移液器、移液枪等。 1.1.2土壤淀粉酶产生菌的纯化 淀粉培养基;前期筛选所得淀粉酶产生菌 1.1.3 土壤淀粉酶产生菌的发酵培养 菌种：前期实验分离得到的菌种，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌;仪器：超净工作台、恒温培养箱、摇床、发酵罐、发酵尾气分析仪、移液器、接种环、酒精灯、记号笔等;培养基：液体发酵培养基 。 1.1.4淀粉酶的活性测定 菌种：产淀粉酶微生物 ;培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养供试菌培养使用；仪器和其它用具：摇床、恒温培养箱、纸片、移液管、淀粉酶标准品、尺、小试管、容量瓶、离心机 1.1.5淀粉酶产生菌的生理生化反应 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄八叠球菌（Saracina lutea）、前期实验分离到的产淀粉酶菌株；培养基：糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）、葡萄糖蛋白胨培养基、胰蛋白胨水培养基；试剂：甲基红指示剂、40%KOH，5%α-萘酚等。 方法 一）土壤稀释液的制备 1.称取土壤10g，放入90ml无菌水的三角瓶中，振荡10分钟，即为稀释0.1的土壤悬液。 2.另取装有无菌试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7.在每支试管中用无菌吸管加入9ml无菌水。 3.取已稀释成0.1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入100的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吸吹数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法依次连续稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底。 二）划线分离 1.每人取无菌培养皿一副，标记。 2.取已熔化的淀粉培养基制平板 挑取初筛平板上水解圈较大的单菌落，进行划线分离，倒置30分钟培养 3.待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜观察是否为单一的微生物细胞，并转移到斜面培养基中，培养至成熟，待用。 三）摇瓶发酵实验 1.种子培养：将保存于冰箱的菌种接入新鲜斜面培养基，选择合适条件。若筛选获得的淀粉酶产生菌为细菌。则30℃培养箱中培养1~2天。将活化的菌种由斜面培养基转接入盛有30ml种子培养基的250ml锥形瓶内，于转速180~220r/min旋转式摇床上30℃培养1~2天。 2.发酵：吸取培养好的种子液3ml，接入多个盛有30ml发酵培养基的锥形瓶内，于转速180~220r/min恒温摇床上30℃培养2~3天。 3.提取：取发酵液20ml，平均分配到两个离心管中，12000r/min离心10分钟，分别收集上清液和菌体，保存在冰箱中，以待淀粉酶效价的测定。 四）标准曲线的制作 1.称取一定量的淀粉酶，溶于无菌水中，配制成一定的浓度的母液。 2.取干净的小试管，编号，将淀粉酶溶液稀释成1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml浓度 3.取一定量（100μL）不同浓度的的淀粉酶标准液，滴于纸片上，置于倒有培养基②的平板上，每幅培养基中均匀的放置纸片4-6张，在30摄氏度恒温培养箱中培养18-20h 4.测定透明圈直径 5.以淀粉酶活力对数值为横坐标，以透明圈直径为纵座标，绘制标准曲线。 五）样品淀粉酶活力测定 1、待测微生物接种