分子生物学技术精讲重点分析.docx

5.1重组DNA技术回顾 本章内容介绍了DNA重组研究的发现历史以及2个基本概念，粘性末端和载体 粘性末端，众所周知，就是一段DNA双分子结构末端突出的只有一条边的几个bp长的DNA短片段，有特定的酶与之对应，能够对它进行切割，即断裂碱基互补配对的分子间作用力，并且切断特定几个碱基组合的一个磷酸二酯键，使之片段分离。 而载体就是一个质粒了，之所以它能够成为载体，必然有其必须的一面，即：能够自我复制和表达，有特定的酶切位点。大多数还有其特定的筛选标记，如氨苄抗性等等。现代常用的克隆载体为大肠杆菌DH5α，表达载体BL21，这两种在分子生物学上比较通用。 本章内容还涉及了氯化钙处理后的大肠杆菌能够变成感受态细胞。氯化钙能够打通细菌的细胞壁和细胞膜，从而能够让质粒载体进入细胞。 另外，T4连接酶能够连接片段和T载体。他们之间连接不靠粘性末端，而靠taq酶的一种特性。Taq酶能够在PCR产物末端加一个A，而T载体刚好是有T在外部暴露的，从而很容易连接。 5.2DNA基本操作技术 5.21核酸凝胶电泳技术 核酸凝胶电泳技术是利用DNA分子在凝胶中的阻滞效果而实现的。 从分子层面来看，琼脂糖或者聚丙烯酰胺一个分子和一个分子之间是有空隙的，不同大小的DNA片段通过同一种空隙的能力是不一样的，大的过空隙的时候，就慢，小的就快，就像胖子和瘦子穿过一个过道是一个效果。所以就在通过空隙的时候DNA不同大小的片段就被分离开了。而凝胶的浓度，决定了这种空隙的大小，越浓，那么空隙就越小，“胖子”穿过空隙就会越慢。从而会有凝胶浓度不同，能分离的DNA片段大小不一样的效果。 核酸染料溴乙锭EB，结合在DNA分子相邻碱基之间，它在紫外荧光下可以显示颜色，便于我们识别DNA在凝胶上的位置。 脉冲场凝胶电泳用于分离超大的DNA片段，因为0.3%的琼脂糖最多分离50000bp的长度，（太胖了，跑得太慢，就基本不动了）所以当我们需要分离的更大，就不得不让DNA在凝胶中反复跑，如果只是像普通电泳中那种直线跑胶方法，那么需要的胶长度，就超乎了你的想象了，所以通过不同的变换方位延长跑胶的长度，一般走的是Z字形，而之所以用脉冲场，就是他太胖了，需要很大的力量推着他走，所以增加了大的电压。 5.22细菌转化与目标DNA分子的增值 细胞转化介绍了2中细胞转化的方法，一种是大肠杆菌的氯化钙改变细胞膜通透性的方法，一种是电转化。两种都是通过将细胞的膜和细胞壁打透，从而能让分子质粒进入细胞。 氯化钙法处理细胞是通过低温下氯化钙造成细胞膨胀，增加了细胞膜通透性，能够粘附DNA分子在其表面热激的时候，黏附的分子由于分子热运动加快，细胞膜透性好，就进入了细胞内部。热激完了以后冷激，细胞膜的通透性就会再次下降，成了包含有重组质粒的大肠杆菌，能够用细菌复制和生长，得到大量所需要的质粒。 电击转化是电脉冲打透了细胞壁，DNA从孔洞中进入细胞。 5.23聚合酶链式反应技术——PCR PCR，聚合酶链式反应，用于体外扩增所需要的目的片段，接下来直入正题。 首先回顾PCR的基础原理：PCR仪，个人认为就是一个能够实现快速变温的温度控制装置，别无他用，而在聚合酶链式反应中，温度的快速改变，是控制DNA结构改变所必须的。 1，DNA一般为双链，首先，我们需要把它进行解链，从而产生两条单链，让引物结合上去，达到复制的目的。一开始我们设置的高温，刚好能够使得DNA双链解体。约94~98℃，用3到5min即可。此反应中我们用的TAQ酶（嗜热杆菌中提取的DNA聚合酶）也是高温启动的，初始的高温适合其开始在体系中的活性，但是约15分钟的高温会导致其半衰期，从而失去活性，使得反应效率降低，所以高温的时间不宜过长。 2，在2~4步骤中，我们进行循环，以达到指数扩增的作用，大量得到所需DNA产物。 3，在2步循环中，第一次的高温是进行预变性，在每一次的开链中都需要在进行一次变性，从而达到开链的目的。预变性同样是94~98℃，时间控制在30S到2min之间，根据片段不同长度而不同。 4，在第三步循环中，我们进行退火，使得温度控制在引物和模板链刚好能够结合的温度使得引物和模板链进行结合。温度约为37~70℃，引物是个人根据基因片段不同而自行设置的，具体设置方法参见引物设计的内容。 设计引物的时候会给出相应的参考TM值，一般小于TM值5℃算作本次PCR的退火温度。如果不行，则根据具体情况调整，梯度PCR，tallPCR反应都是可以尝试的。 5，第四步延伸，在引物结合在模板上进行合成，复制得到引物起始和模板链尾部的新片段。 温度约为72℃，时间： taq酶的活力是1000bp/min，根据所需片段，自行计算延伸时间。Pfu酶延伸速率为500BP/min 在多次循环以后，得到的片段大多是两个引物控制的部分。即目的片段。在第