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生物选修3知识点专题1 ? 基因工程 概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物 新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 基本原理：让目的基因在受体细胞内稳定且高效的表达 理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构，遗传信息传递方式 核心：构建重组DNA分子 基本工具（技术基础） Cf 工具工具酶 1.限制性核酸内切酶 （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的 （不切割自身DNA的原因：原核生物中无该限制酶的识别序列或其已被修饰） 功能：识别和切割DNA分子内一小段特殊的脱氧核苷酸序列（偶数碱基对回文序列） 特异性表现：识别特定片段、切割该片段中的特定位点、形成一种末端 Cf —G↓GATCC— —↓GATC— 结果：DNA片段末端形成末端碱基互补的黏性末端或平末端 ①用 切割（质粒） ②根据目的基因的位置或剪辑序列来确定限制酶的种类 ③切割后片段需要画三段 2.DNA连接酶 （1）功能：连接具有末端碱基互补的2个DNA片段，形成重组DNA分子 Cf DNA聚合酶：只能将单个脱氧核苷酸逐个添加到已有的脱氧核苷酸链之后， 需模板DNA，连接磷酸二酯键 3.载体 （1）条件：①能在受体细胞中稳定保存并大量复制，基本不影响受体细胞正常生命活动 ②一至多个限制酶酶切位点（必须在所需标记基因外），供外源DNA片段插入 ③标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的受体细胞 ——往往需要根据需求改造天然载体 功能：①作为运载工具将目的基因转移到受体细胞内 ——载体选质粒的原因：具有环状结构，能够携带目的基因 ②利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制和转录/表达 质粒（最常用的载体） 一种能够自主复制，在细菌(或酵母菌)中独立于染色体之外存在的双链环状DNA分子 （4）其它载体：噬菌体、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：获取目的基因 目的基因：人们所需要的编码蛋白质的结构基因 方法 序列已知 ①化学合成法 ——较长DNA单链合成过程中容易出现碱基缺失 如 反转录法（e.g获取mRNA逆转录成cDNA再用DNA聚合酶生成双链） ②聚合酶链式反应(PCR)扩增Polymerase Chain Reaction （1）原料：水、缓冲液、4种游离脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA(……基因)、 对…基因特异的2段DNA引物（防止相互或自身折叠） （2）过程：第一步：加热至90～95℃，DNA在高温下变性解链 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链（退火） 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成 能量来源于温度 (2)序列未知 建立基因文库： 建立一个包括目的基因在内的基因文库(保存在受体菌中)，再从基因文库中获取 3.目的基因大量扩增/分子水平的克隆 ①利用受体细胞（如E.coli）无性繁殖，利用基因探针钓取，再导入最终受体细胞 e.g目的基因→大肠杆菌→农杆菌→植物细胞→植物 （主要在细菌分裂时几何级扩增，尽管质粒独立于拟核，可在分裂时发生自我复制， 但由于多数细菌对胞内质粒数量有限制，故该种复制对扩增效果不大） ②PCR技术 第二步：形成重组DNA分子（基因表达载体：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因） 目的：转运目的基因，并使在受体内稳定存在、复制、表达/转录并稳定遗传（基因型X0） 过程：（1）单酶切：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端， 然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来 ——有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端 （2）双酶切：用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端，防 止载体和目的基因自身环化 第三步：将重组DNA分子导入受体细胞 ——将目的基因整合到动植物细胞的染色体DNA上，原核生物不需要，噬菌体不一定整合