实验技术—HE染色重点分析.docVIP

小鼠胚胎切片原位杂交 主要试剂及配制方法： PBS储存液（0.5 L体积配方）：g NaCl ，g Na2HPO4·12H2O 和1.763 g NaH2PO4·2H2O，然后加入400mL ddH2O充分搅拌溶解，用固体NaOH将pH调节至7.4，然后加入ddH2O定容至0.5 L，最后各组分终浓度为NaCl=1.3mol/L，Na2HPO4=70mmol/L，NaH2PO4=30mmol/L，高压灭菌后室温保存备用； 1×PBS工作液：将10×PBS储存液用灭菌水稀释10倍即可； 10×甘氨酸溶液：称取甘氨酸g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。5M NaCl：在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L，高压灭菌后室温保存备用； 1M Tris-HCl ( pH7.5 ，pH9.5)：在800ml水中溶解121.91g Tris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值（应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值），然后加水定容至1L，最后高压灭菌室温保存备用； 1M MgCl2 ：在800ml水中溶解203.4g MgCl2·6H2O，用水定容至1L，高压灭菌室温保存备用 20%（W/V)SDS：20 g SDS溶解于80 mL ddH2O中，加热的同时用玻璃棒搅拌助溶，用浓盐酸调节pH值到7.2，加水至100 mL，高温高压灭菌，室温保存备用ddH2O稀释10倍即可使用； 2 μg/mL Proteinase K/PBS：使用时配制，将Proteinase K (20mg/mL，-20 (C冷冻保存）用PBS稀释10000倍使用； 乙酰化试剂：如配制40 mL溶液，需加入530 (L三乙醇胺，100 (L冰乙酸，70 (L 浓HCl，ddH2O定容至40 mL； NT Buffer：各种成分终浓度( pH7.5 )，0.15 M NaCl。如配制1 L该溶液，需加入100 mL 1M Tris-HCl ( pH 7.5 )，30 mL 5 M NaCl，ddH2O定容至1 L； NTM Buffer：各种成分终浓度为0.1 M Tris-HCl ( pH9.5 )，0.1 M NaCl，0.05 M MgCl2。如配制40 mL该溶液，需加入4 mL 1 M Tris-HCl ( pH 9.5 )，0.8 mL 5 M NaCl，2 mL 1 M MgCl2，ddH2O定容至40 mL； 20×SSC：如配制250 mL该液体，需要加入NaCl 43.8 g，二水合柠檬酸钠（C6H5O7Na3·2H2O） 22.1 g，然后加入ddH2O至200 mL，加入HCl或NaOH调节pH至7.0，最后定容至250mL，高压灭菌备用； 50×Denhardts：10g聚蔗糖（Ficoll 400)，10g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），10g牛血清白蛋白（BSA）用水定容至1L，过滤后-20 保存备用； 杂交液（预杂交液）：即5×SSC Hybridization Buffer，各成分终浓度及用量如下表： 50% 去离子甲酰胺 25mL 50% 20×SSC(pH7.0) 12.5mL 5× 20×SSC(pH7.0) 12.5mL 5× 50× Denhardts 5mL 5× 50× Denhardts 5mL 5× 100mg/mL酵母tRNA 125μL 250 μg/mL 100mg/mL酵母tRNA 125μL 250 μg/mL 100mg/mL鱼精DNA 250μL 500 μg/mL 20%SDS 2.5mL 1% 100mg/mL肝素 25μL 50μg/mL DEPC水 7.125mL DEPC水 4.85mL Total 50mL Total 50mL 注：配制好的预杂交液在-20(C保存备用； 马来酸缓冲液：含100mM马来酸（Maleic acid,顺丁烯二酸）和150mM NaCl，pH为7.5；如配制500mL该缓冲液：向400mL去离子水中加入4.38g NaCl和5.81g马来酸，然后加入适量固体NaOH调节pH至7.5，定容为500mL，灭菌后-20℃保存备用； 10×封闭剂（Blocking Reagent)：向80mL马来酸缓冲液中加入10g的脱脂奶粉粉末，搅拌后定容至100mL，该溶液很难溶，需加热，可以直接高压灭菌致溶，然后-20℃保存备用；10×封闭剂 抗体溶液：抗体原液用1×封闭剂稀释5000倍后使用，可回收存于4再使用； NBT溶液：把0.75g氯化氮蓝四唑（NBT）溶解于10mL70%的二甲基甲酰胺中,保存于4℃。 BCIP溶液：把0.