生物制药技术重点分析.doc

酶 分离纯化酶的一般程序1粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离 3酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳） 4浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥 酶的主要纯化技术－层析技术 利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数)，使各组分以不同的比例分布在两相中，当流动相以一定的速度流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离的技术过程。称为层析技术（chromatography） 离子交换层析（ion exchange chromatography） 在一定的pH条件下，带电荷的蛋白质与高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团相吸附，流动相中解离的离子与被吸附的酶发生可逆的交换，而对不同吸附能力的蛋白质进行分离 离子交换剂的选择：阴离子交换剂用于处理净电荷为负的蛋白质，阳离子交换剂用于处理净电荷为正的蛋白质 样品在低离子浓度条件下上柱，逐渐增加洗脱液的离子浓度，使蛋白依次被洗脱下来 洗脱方式可以是步进式洗脱或线性梯度洗脱 洗脱液一般用 NaCl 凝胶过滤法（gel filtration） 亦称分子筛层析、排阻层析，是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析分离的一种方法 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出； 分离提纯 脱盐 测定高分子物质的相对分子量 疏水层析（hydrophobic chromatography） 原理：蛋白质分子中含有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等疏水性较强的氨基酸，当蛋白质溶液经过疏水层析介质的疏水配基时，蛋白的疏水性集团（疏水补丁）会与疏水配基发生亲和作用而被吸附在介质上。不同蛋白质分子中疏水基团的数量和特性有所不同。在洗脱时通过改变洗脱液的极性达到分离的目的 亲和层析（affinity chromatography） 也称功能层析、生物专一吸附或选择层析。根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法 酶与激活剂/抑制剂/底物/辅酶；抗原与抗体；激素/配体与受体；蛋白质与DNA/RNA上特定区域 特定的配基（激活剂/抑制剂/底物/辅酶）固定于惰性载体 目的酶与配基特异性亲和吸附，杂质被洗脱 改变洗脱条件，解除目的酶与配基的专一性结合 固定化酶（细胞）的定义 优点： 1.稳定性显著提高； 2.同一批固定化酶能重复多次地使用； 3.固定化后，很容易与反应物分开（过滤），不污 染产物，而且有利于控制生产过程，同时也省去了 热处理等使酶失活的步骤； 4.可长期使用，并可预测衰变的速度； 5.提供了研究酶动力学的良好模型。 缺点： ①固定化时，酶活力往往有损失。 ②增加了生产的成本，初始投资大。 ③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。 ④非均相反应。 ①注意维持酶的催化活性及专一性。在酶的固定化过程中，酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 ②固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。 ③固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 ④酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。 ⑤固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或溶剂发生化学反应。 ⑥固定化酶成本要低，以利于工业使用。 载体结合法 1物理吸附法2离子结合法3共价结合法 是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。 1）物理吸附法 作用方式：非特异性物理吸附作用：范德华力；氢键；疏水作用；静电作用 优点：制作简单，酶分子的构象很少或基本不发生变化，固定化酶活力较高 缺点：酶与载体结合力弱，酶易从载体脱落 载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等 2)离子结合法 作用方式：离子键结合 优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。 缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。 载体：多糖类离子交换剂，合成高分子离子交换树脂 3)共价键结合法 作用