绿色荧光蛋白讲义.docVIP

绿色荧光蛋白GFP的研究与应用 中国·长春 2013 年 12 月 绿色荧光蛋白GFP的研究与应用 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。 关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用 1 引言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962 年,等从维多利亚多管水母中分离纯化生物发光蛋白质水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出非常明亮, 浅绿色荧光的副产物。1974 年,等纯化得到了这种自发荧光的蛋白即 GFP。瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会 GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠在氧存在的条件下使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65~67位的氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮，形成生色团。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450~490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中GFP的一个引人注目的特点是其生色团的形成没有物种的特异性，可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。Cubitt等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。 4 GFP的荧光性质及应用优点 （1）易于检测灵敏度高。荧光反应不需要外加底物和辅助因子只需紫外光或蓝光激发即可发出绿色荧光用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次即便是未经纯化的发射的绿光也是相当强的在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。 荧光性质稳定。对光漂白一种荧光衰减现象有较强的耐受性能耐受长时间的光照从而延长了可探测时间在范围内也能正常发光对高温℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。 对细胞无毒害。从目前的研究结果来看对生活的细胞基本无毒害与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响转化后细胞仍可连续传代。 构建载体方便。由于编码的基因序列很短所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒而不至于使质粒过大影响转化频率。 可直接用于活细胞测定。是能在异源细胞内表达后能自发产生荧光的蛋白并且的分子量较小端和端都能忍受蛋白的融合是理想的标记物可进行活细胞实时定位观察更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态还可实时观察到外界信号刺激下目的蛋白的变化过程借助荧光显微镜观察使研究更为方便。使用激光共聚焦显微镜其图像效果更佳结合现代的计算机软件可进行三维显示。 不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有因此不会出现假阳性结果作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料扩散造成的定位不准使结果真实可靠。 广谱性。表现在的表达几乎不受种属范围的限制在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达其次是没有细胞种类和位置上的限制在各个部位都可以表达发出荧光。 易于得到突变体。如中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体且增强了荧光强度适合在不同物种中专性表达。 β-葡萄糖苷酶(CUS)基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时空成像方面。 5.1.2 GFP作为融合标签 最成功的一类应用就是把作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用或者靶向标记某些细胞器。在多数情况下基因在或末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性又表现出与天然相似的荧光特性。的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化并依靠荧光共振能量转移即来进行检测。 5.2.1 检测 野生型和其许多突变体都具有依赖于的荧光变化因而可以被用来检测活细胞内的。人们通常称它们为。分为两类比率和盈缺。当降低时比率的最大激发波长从到迁移利用两个最大波长处的荧光强度的比率可以测量当值小于时盈缺在处没有荧光。当回复到中性时两类都会在内复原。 检测卤素离子 变体不但对敏感而且对不同离子也同样敏感故可以用来检 测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递其他检测应用 另外可以应用于检测