免疫印迹-091208讲义.doc

Western blotting(2007.7) 洗净玻板，与胶接触的一面倾斜朝下晾干。放入电泳橡胶套内卡好(有框为高;平面为低） 封板： （配胶全过程须戴手套和口罩，被有毒物质污染的手套必须丢弃！) 1%琼脂糖(微波加热, 液体刚沸腾即可)全溶后用枪将电泳橡胶套底部封好（两面） 一块胶约2—4ml [琼脂糖0.5 g，加水至50ml] 将其装入电泳槽内，玻璃板高的一边通正极（红色钮） 蛋白从负极向正极跑 分离胶：配胶（附后），一般分子量大的按10%配(or 8%)，分子量小的按12%配， 10%的过硫酸铵现用现配，10%的SDS加热溶解后再用 15-20 ml/板 将电泳槽倾斜，将上述分离胶注入至离上样梳约1cm，并在上面加2-3mm 高的异丙醇 约500 ul/板，目的防止氧气扩散进入凝胶而抑止聚合反应 约30min后凝固，倒出异丙醇，并用去离子水冲洗10次，再用滤纸轻轻吸出残余的水 长时间(2-3h)有利于胶结构形成，因为肉眼看胶凝时，胶内部分子的排列尚未完成 基层胶：基层胶的配制（附后，室温时胶凝聚比较快，夏天约需5 min，5-6ml/板) 将剩下的基层胶放置冰水中可延缓胶凝聚 基层胶如果收缩应及时补胶 插上上样梳(必需是干净干燥的，倾斜插入以排气泡)，注意上样梳的下沿要距离分离胶约1cm 待基层胶凝固后往电泳槽倒入满电泳缓冲液 一槽 二槽 三槽 四槽 五槽 5×电泳缓冲液 160ml 320ml 480ml 640ml 800ml ddH2O 640ml 1280ml 1920ml 2560ml 3200ml 9、倒入电泳液后缓慢拔出上样梳 凝聚的胶与不凝聚的胶有不同的折光率，故可分辨 拔上样梳后若胶齿弯曲，用9#注射针头将其扶直 10、上样： 收细胞：1、培养液倒入离心筒，胰酶消化细胞，也倒入离心筒，2500-3000 r/min, 10 min， 倒掉上清液 2、1ml PBS重悬细胞转移至1.5 ml EP管，2500-3000 r/min, 10 min;大枪头吸弃上清液 3、2500-3000 r/min, 2-3 min , 小枪头吸弃上清液。-80℃冻存 裂解： 1、每管细胞加60-100 ?l裂解液，于4℃冰箱内冰浴1 h 2、12,000 r/min离心10-15 min，用枪头吸出上清至0.5 ml EP管 3、加5×上样缓冲液，沸水浴3-5 min。-20℃或-80℃冻存 方法：每个泳道加15-20 ?l的样品(约30-100 ?g，每个泳道上样量必须一致)。 Marker(4-6 ?l)加在第一个泳道或合适的泳道。（如果是新的Marker,则每瓶加200 ?l 5×上样缓冲液，分装放于-20℃保存） 加的样品不要溢出胶齿上部 通电：基层胶的电压U=75～85V （80V）Marker显示的位置，按分子量大小剪成一个个条带 封闭：将封闭液均匀涂在剪下的蛋白条带上，室温摇床缓慢振荡封闭2h以上 封闭液； 脱脂奶粉 [5%（V/V）] 0.5g 1.5g 2.5g 0.02% 叠氮钠 0.002g 0.006g 0.01g 1× PBS 10ml 30ml 50ml 加一抗：把含一抗的封闭液滴在塑板上，将条带从封闭液取出，滤纸贴角吸干，正面 朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，在反应体系外罩一湿润平皿以防止溶液蒸发 孵一抗通常4度过夜 通常40ul-50ul/cm2 一抗溶液加入叠氮钠，可在4℃存放至少2周 加二抗： 洗一抗：先用PBS洗3次，10min/次，并在摇床上振摇 再用Tris-NaCl (PH 7.5)洗1次，10min/次 涂二抗：根据一抗的来源选择合适的二抗，按相应的比例稀释，室温孵育2h 二抗的配制方法： 脱脂奶粉 [5%（V/V）] 0.25g 0.5g Tris-NaCl(PH 7.5) 5ml 10ml 二抗 稀释300-500倍 显色（本方法为DAB法，现多用ECL法） A、二抗孵育2-3h后（室温），用Tris-NaCl洗3次，10min/次，并振摇 B、加底物，显色5min 底物的配制： Tris-HCl (0.01M，PH 7.6) CoCl2,还有30%的H2O2 10?l/10ml底物液（10ml加10?lH2O2Maker 蛋 白 蛋 白 ATM 236 EGFR 170 TrkB 145 PLCr2