转录产物的加工分析.pptVIP

原核生物rRNA前体的加工 前体rRNA的加工过程 ① 转录产物内部碱基配对折叠形成茎环结构 ②茎环结构与蛋白复合，形成 RNPs ③特定碱基的甲基化(S-腺苷甲硫氨酸，SAM) ④酶的剪切，首先 RNaseⅢ剪切释放出16S、23S前体分子， RNaseE剪切释放出5S前体分子；随后 RNase M16、M23 、 M5分别在其前体分子末端进一步剪切，最终释放成熟的rRNA分子 真核生物的tRNA加工 酵母tRNATyr加工为例 ①转录产物前体具有特征 茎环结构的二级结构 ②RNAaseP D内切酶识别 二级结构，并切除5’端16nt 前导区和3’ 端额外的2nt 3’端加尾 加尾过程 ① 特定的蛋白因子识别信号序列后，结合前体mRNA上，组装成复合体 ②内切酶CF (cleavage factor)在AAUAAA下游11～20 nt 的特定位点对前体mRNA进行剪切; ③聚腺苷酸聚合酶PAP在3’端添加多至250个A残基 ④ PABP 结合到poly(A) 在II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近3-端d6结构中的分支点保守序列上A的2-OH向5-剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1的3-OH，内含子5-端的磷酸基与分支点A的2-OH基形成2, 5-磷酸二酯键，产生套索结构，完成第一次转酯反应。接着，外显子1的3-OH亲核攻击3-剪接位点，切断3-剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子1与外显子2之间的3, 5-磷酸二酯键，完成第二次转酯反应。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有套索结构的内含子。 尽管某些II型内含子在体外就能够完成自我拼接，不需要任何蛋白质的帮助。但在体内，有一种拼接因子即成熟酶参与了II型内含子的剪接。成熟酶是由内含子编码的逆转录酶(RT)，与其中内含子d6结构中的分支点保守序列有很高的亲和力，二者相互结合后，由于蛋白质-RNA的相互作用，导致内含子构象发生变化，促进了RNA的拼接反应。在拼接结束以后，RT仍然与释放的内含子结合，参与随后的转座反应。 II型内含子主要的转座事件是归巢(homing)，归巢的实质是以内含子RNA作为模板，将逆转录合成的DNA插入靶位点。逆转录反应由与RNA内含子结合的RT催化，属于靶位点为引物的逆转录。如图8-20所示，归巢反应开始于双链DNA外显子连接点上RNA内含子在靶位点的反拼接(reverse splicing)插入，这一步由RNA催化，RT协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后，RT的En结构域在下游9 bp～10 bp的位置切开DNA的另一条链，再由RT催化，以被切开的DNA链作为引物进行逆转录反应。最后，通过DNA的修复合成和连接完成内含子的插入过程。 8.5.3 内含子剪接机制的比较 从内含子的剪接机制来看，I型内含子、II型内含子和核pre-mRNA剪接的III型内含子是相似的，只有tRNA的IV型内含子剪接机制完全不同。 对比研究发现，III型内含子的剪接体内snRNA的整体形态和II型内含子自我剪接时的形态类似，特别是剪接体的snRNA和II型内含子的催化部位之间的结构和功能十分相似。可以认为，这些snRNA可能来自早期自我剪接系统的II型内含子。例如，Ul snRNP和5-端剪接点配对，U6-U2和分支点序列配对形成的空间结构，与 II型内含子本身d5和d6配对形成的空间结构很相似。看来，在生物进化过程中，snRNA和mRNA前体之间的相互作用，取代了II型内含子剪接过程中有关片段之间的相互作用。与II型内含子自身的结构相比，snRNP具有更加复杂和完善的结构，因而具有更加高级而复杂的调控功能，和更加高效的催化功能。 I型内含子与II型内含子都能够完成自我剪接，不像III型内含子那样需要结构复杂的剪接体。正因为如此，I型内含子与II型内含子剪接的效率和调控远远比不上III型内含子。I型内含子的剪接反应使用外源鸟苷酸或鸟苷，II型内含子的转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，由内含子内部的腺苷酸引起，也许II型内含子剪接的效率和精确度比I型内含子更好一些。 1985年Cech等通过进一步研究，从切除的内含子中分离得到L19RNA，并发现其可在体外催化一系列分子间的反应，如转核苷酸反应、水解反应、转磷酸反应等。L19RNA催化的转核苷酸反应如图8-21所示，可以看出，L19RNA既可从寡聚C切除核苷酸(图8-21①和②)，也可在寡聚C上添加核苷酸(图8-21③和④)，其催化过程具备酶的所有基本特征。 8.6 核酶 8.6.1 核酶的发现 1982年C