育种学尹继乾分析.ppt

PEG融合所需试剂 融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液： A液（g/100ml）pH6.0 B液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169 （5）生物诱导融合法——仙台病毒法 仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径为50～60 nm，由两层磷脂组成的外膜包裹着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小）。 诱导细胞融合的机理：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细胞凝集块再通过膜上蛋白质分子的重新排列，使膜中脂类分子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。 * 百子莲属植物 绞股蓝丝瓜 烟草的细胞融合 体细胞杂交（原生质体融合） 体细胞杂交研究历程及一般概念 体细胞杂交的一般流程 细胞融合的类型 1 2 3 杂种细胞的选择 4 1.体细胞杂交的含义及研究历程 2.植物细胞融合的程序 3.细胞融合的类型 4.杂种细胞的选择 5.原生质体融合的应用 1.体细胞杂交的含义及研究历程 概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。 ◆使植物无性杂交成为可能 ◆使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实 ◆打破了物种间的界限 原生质体融合的意义 2.植物细胞融合的程序： ◆ 原生质体分离的分离、纯化 ◆ 融合方法选择 ◆ 杂种细胞的筛选 ◆ 愈伤组织形成、分化植株再生 ◆ 杂种植物的鉴定 原生质体融合的方法 聚乙二醇 PEG） 化学方法 电脉冲 物理方法 生物方法 仙台病毒 (Sendai virus) NaNO3处理 高pH-高浓度Ga2+ 飞秒激光诱导融合 电融合 空间细胞融合 （1）电融合法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。 ◆电融合特点： 效率高 对原生质体伤害性小 对融合细胞数易于控制 方法：微电极法和双向电泳法 双向电泳法：通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。 电融合仪 微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。 1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近； 2、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布； 3、细胞质发生融合； 4、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。 融合过程： （2）聚二乙醇 诱导融合法 ◆PEG融合的机理： PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。 当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类脂膜流动性作用，引发原生质体的粘连。 当PEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体融合。 PEG的选用：一般选择相对分子质量为4000获6000 PEG 对细胞有毒害作用，用离子交换树脂纯化可消除其对细胞的毒害作用。 优点：成本低、不需要特殊的设备；融合子产生的异核率高；融合过程不受物种限制 缺点：融合过程繁琐、PEG可能对细胞造成毒害 P1 P2 P1 P2 混合静止1 min. 融 合 融合液 加入PEG 稀 释 洗 涤 加入稀释液 加入培养基 培 养 选 择 PEG法的流程 P1 P2 P1 P2 融 合 融合液 稀 释 洗 涤 培 养 选 择 盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2 氯化物类：NaCl、CaCl2 、MgCl2 、 BaCl2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏