实验7-厌氧菌及厌氧培养法.pptVIP

厌氧菌及厌氧培养法、结核杆菌等的鉴定 黄红莹 目的要求 1. 掌握破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、炭疽杆菌、钩端螺旋体的形态特征 2. 熟悉厌氧培养方法 3. 掌握抗酸染色技术 实验材料 1. 细菌标本片 1盒/组 2. 卡介苗、抗酸染液、玻片 实验内容 1. 标本片观察 画图 2. 抗酸染色 形态学观察 破伤风梭菌：革兰氏阳性细长杆菌，散在排列；芽孢位于菌体顶端，呈圆形，直径大于菌体；具有周鞭毛 产气荚膜梭菌：革兰氏阳性粗大杆菌，两端钝圆，散在或短链状排列；具有肥厚荚膜；芽孢卵圆形，与菌体等宽，位于菌体中央或次末端 肉毒梭菌：革兰氏阳性粗大杆菌，两端钝圆，单独或成双排列；芽孢卵圆形，宽于菌体，位于菌体次末端，使细菌呈“网球拍”状；具有周鞭毛 结核杆菌：细长、略有弯曲杆菌，两端稍圆，菌体内可含2～5个以上浓染颗粒，呈念珠状。常单独存在，也可见平行、成束排列或成一定角度排列，也可见团聚成堆现象 白喉棒状杆菌：革兰氏阴性，一端或两端膨大成棒状；Neisser染色菌体呈棕黄色，异染颗粒呈棕褐色，菌体呈X、Y、W等字母形或栅栏状排列 炭疽杆菌：革兰阳性，产生芽孢的粗大杆菌；菌体两端平截，甚至向内凹陷；芽孢小于菌体，位于菌体中央、卵圆形 钩端螺旋体：细长丝状、圆柱形、螺旋盘绕细致、一端或两端弯曲呈钩状，菌体常呈C、S或8字形 抗酸染色法 抗酸性细菌如结核杆菌等分枝杆菌属细菌，细菌细胞壁有很多脂类物质，石碳酸复红加温染色后，其中的分枝菌酸与石碳酸复红结合成牢固的复合物，能够抵抗盐酸酒精的脱色，使菌体保留红色，故称抗酸染色法。 其他非抗酸菌和组织细胞因不能抵抗盐酸酒精的脱色，被脱成无色，后经碱性美兰染色后染成兰色。 材料: 菌种：卡介苗 染液：抗酸染色液(石碳酸复红、3％盐酸酒精、吕氏美兰) 其他：玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、显微镜等 方法： 细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定 　　染色：抗酸染色法 油镜使用：观察染色结果并记录 步骤： 结果： 　　红色－－抗酸染色阳性菌 　　兰色－－抗酸染色阴性菌 意义： 　　用于鉴定分枝杆菌属细菌 细菌的厌氧培养 庖肉培养法：此法为利用动物组织促进还原法。培养基中的肉渣含有不饱和脂肪酸和谷胱甘肽，能吸收培养基中氧，使氧化还原电势下降。加之培养基表面用凡士林封闭，使与空气隔绝而造成厌氧条件。 先于火焰上稍加热，使庖肉培养基上面的石蜡或凡士林融化，用无菌毛细管吸取待检标本，接种于培养基中，再加热液面上的石蜡凡士林使其融化，然后直立试管，石蜡凡士林凝固并密封培养基后，(如作厌氧芽胞菌分离，接种后将肉渣培养基置80℃～85℃水浴10min处理)，置35℃～37℃温箱培养2d～4d观察结果。 碱性焦性没食子酸法：焦性没食子酸与碱能生成棕色的焦性没食子橙，此碱性溶液能迅速吸收空气中的氧，造成厌氧条件。 取洁净无菌的培养皿盖，在其背面铺一薄层灭菌的脱脂棉或纱布，将1g焦性没食子酸放在其上,滴加2.5mol/L NaOH 2ml,迅速将已经接种好的平皿底倒扣在盖上，周围用融化的石蜡密封，置35℃～37℃温箱培养24h～48h观察结果。 硫乙醇酸钠法：硫乙醇酸钠是还原剂，能除去培养基中氧或还原氧化型物质，有利于厌氧菌生长。 厌氧箱培养法：是一种较先进的厌氧菌培养装置。适合于处理大量标本。标本接种、分离培养和鉴定等全部检验过程，均在箱内进行，有利于厌氧菌检出。厌氧箱是由手套操作箱和传递箱两个主要部分组成。   微生物学检查法 标本的采集 从感染中心处采取，避免正常菌群污染 采取后立刻放入厌氧标本瓶中，迅速送检 直接图片镜检 分离培养 牛心脑浸液血平板 厌氧培养 鉴定：生化反应 气液相色谱法 分子生物学方法 * 18-24h 24-48h 原理 石碳酸复红初染 3％盐酸酒精脱色 吕氏美兰复染 加温染5分钟 影响抗酸染色的关键步骤是脱色 冷却后水洗 水洗 水洗 1min 干燥 *