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实验十三 血清甘油三酯的测定 血清甘油三酯测定方法较多，但主要包括提取、吸附、皂化、氧化，还原及显色等步骤。近年发展的酶学方法测定操作步骤虽然简单，但要许多纯酶制剂，此外还有光散射测定法，亦需要特点器材，故不易推广使用，现介绍两种常用的方法： 一、酶法测定甘油三脂 【目的】 1. 熟悉酶法测血清TG的基本原理及注意事项。 2. 熟练进行实验操作。 3.了解TG测定主要临床意义。 【原理】 酶法测定是用脂肪酶或脂蛋白脂酶(LPL)使血清中甘油三酯水解，生成甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶(GK)催化下，生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在甘油磷酸氧化酶(GPOD)的催化下，生成磷酸二羟丙酮和H2O2。然后，以Trinder?反应 甘油三酯 L P L 甘油+3脂肪酸 甘油+ATP G K 3-磷酸甘油+ADP 3-磷酸甘油 GPO D 磷酸二羟丙酮+ H2O2 H2O2+酚+ 4 - 氨基安替比林 红色醌亚胺 + H2O 【器材】 试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。 【试剂】 甘油三酯试剂盒（3 v） 【操作】 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 血 清 0.01 — — 标准液(1.13mmol/L) — 0.01 — 酶试剂 1.0 1.0 1.0 混匀，置37℃水浴15min, 以空白管校“0”， 500 nm波长比色， 取测定管光密度值。 【计算】 血清甘油三酯( mmol/L) = AR/AS ×1.13 【正常参考范围】 正常参考范围： 0.56~1.70mmol/L 【注意事项】 1.配制后的酶试剂可在4℃存放4天,几种酶中以甘油激酶较易失活。 2.标本应新鲜,血清放置时间长可使游离甘油浓度升高。 二、乙酰丙酮显色法 【目的】 1．了解乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯的原理； 2． 熟练进行实验操作。 3. 了解TG测定主要临床意义。 【原理】 血清中甘油三酯经正庚烷一异丙醇混合溶剂抽提后，用氢氧化钾溶液皂化成甘油，并进一步用过碘酸氧化成甲醛，在NH4＋的存入下，甲醛与乙酰丙酮反应生成3,5—二乙酰—1,4—二氢二甲基吡啶，后者为带荧光的黄色物质。与同样处理的标准液比色计算，即得血清中甘油三酯的含量，反应式如下： 【器材】 试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。 【试剂】 1、抽提剂：正庚烷/异丙醇＝2/3.5（v/v） 2、0.04MH2SO4 3、异丙醇（A.R） 4、皂化试剂：取6.0gKOH溶于60ml蒸馏水中，然后取异丙醇40ml混合，置棕色瓶中室温保存。 5、氧化试剂：称取65mg过碘酸钠溶于约50ml蒸馏水，然后加入7.7g无水醋酸铵溶解，再加6ml冰醋酸，并加水至100ml。贮棕色瓶内室温保存。 6、乙酰丙酮试剂：0.4ml乙酰丙酮加到100ml异丙醇中，混匀，置棕色瓶内室温保存。 7、三油酸甘油酯标准液： 贮存液(0.1mmol/l）：精确称取三油酸甘油酯1.000g，溶解于抽提剂中，定容至100ml，置冰箱存。 应用液（0.01mmol/l）：贮存液用抽提剂10倍稀释，置冰箱保存。 【操作】 带塞试管3支，编号，按下表操作： 测定管 标准管 空白管 血清（ml） 0.2 — — 应用标准液（ml） — 0.2 — 蒸馏水（ml） — 0.2 0.2 抽提剂（ml） 2.5 2.3 2.5 0.04MH2SO4(ml) 0.5 0.5 0.5 边加边摇，加好后，剧烈振摇15分钟，静置分成二相后，准确吸取各管上层清液0.3ml，分别加至另外三支试管中。按下表操作： 异丙醇（ml） 1.0 1.0 1.0 皂化试剂（ml） 0.3 0.3 0.3 充分混匀，置65℃水浴中3分钟 氧化试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 乙酰丙酮试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 混匀，置65℃水浴中15分钟，取出后冷却，于420nm处，以空白管调零点，读取各管光密度。 【计算】 甘油三酯 =　 　　　×0.2× ×0.01129 = ×100×0.01129 注：mg/ml×0.01129 = mmol/L 【正常参考范围】 0.113-1.69mmol/l 【注意事项血清三脂酰甘油有随年龄增长而上升的趋势，体重超过标准者往往偏高。正常成人空腹给脂肪餐(脂肪1g／kg体重)后，一般2～4小时内血清混浊程度及三脂酰甘油含量达高峰，8小时后恢复正常。脂肪清除作用较差的人，清除时间延长。血中的三脂