实验六石蜡切片法分析.ppt

实验六 石蜡切片法 —— 包埋、切片和贴片 石蜡切片法 石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握，同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。 石蜡切片的主要过程 取材——固定保存——冲洗——脱水————透明——石蜡透入——包埋——修块——切片——贴片——复水——染色——脱水——封藏——观察保存 （一）包埋 （二）修块、切片、贴片 （三）染色、封藏 一、实验目的 掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求； 熟练掌握石蜡切片的关键步骤——包埋。 学习旋转切片机的使用方法，熟练掌握石蜡切片的关键步骤——切片。 二、实验材料及用品 实验材料：植物叶片、小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；温箱、包埋盒、水盆等、切片机、毛笔等。 实验药品：石蜡、蛋白黏贴剂。 三、实验步骤（1） 取材（根据制片目的和要求而定，代表性）； 杀死和固定： 小鼠利用引颈致死法迅速杀死，取其肝脏，用生理盐水冲洗干净后分割成0.5~1cm×0.5~1cm×0.3cm 小块投入Bouin’s固定液中进行固定； 植物叶片采集后分割成1~1.5c㎡小块后投入FAA固定液中进行固定； 冲洗 小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用70%或50%AL进行冲洗； 植物叶片经FAA固定液后使用流水进行冲洗 脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 50% 70% 80% 95% 100%AL 100%AL 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜，则停留在70%酒精中。 三、实验步骤（2） 透明（置换，作用？） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （?二甲苯+ ?100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。 脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果： （1）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。 （2）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。 浸蜡： 要点：使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地贴在细胞壁的内外，成为不可分离的状态； 原则：低温 高温、低浓度 高浓度 三、实验步骤（3） 包埋：就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸盒中，使之凝固。 包埋前折纸盒 包埋时将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速且轻轻地用温镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢平放于水盆的水面上，待蜡盒内的石蜡表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水从一边浸入纸盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋块迅速凝固，待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。 包埋过程中易出现的问题及解决办法 问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。 三、实验步骤（4） 修块：削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm ； 修块的目的： 1）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲； 2）每个切片组织的距离接近，便于镜检或作连续切片。 要求：组织块必须 ①上下平行，② 但左右的蜡、上下的蜡不要太多或太少；③正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。 三、实验步骤（5） 切片：用锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，一般用专门的切片机和切片刀。 切片机的结构： 控制切片厚薄的微动装置； 供装切片刀的夹刀部分； 供装置组织块的夹物部分。 切片机的类型根据结构分为： 滑行式切片机：夹刀部分是滑动的，而夹