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第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式 第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法 动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁—悬浮培养。 悬浮培养（suspension culture)：让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。 它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。 ◆优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，可借鉴许多有关细菌发酵的经验。 ◆不足：较难采用灌流培养，细胞密度一般较低。 目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐生物反应器和气升式生物反应器。 悬浮培养 贴壁培养（anchorage-dependent culture）是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。 它适用于一切贴附依赖性细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。 ◆优点：适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度； ◆不足：操作比较麻烦，需要适合的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。  目前应用较多的贴壁培养方法有：转瓶培养法、固定床式生物反应器等。 贴壁培养在传代或扩大培养时常常需要用酶将细胞从基质上消化下来，分离成单个细胞再进行培养。 细胞转瓶培养器 （贴壁培养） 贴壁—悬浮培养（假悬浮培养） 将悬浮培养和贴壁培养二者结合起来，优势互补，形成的一种更理想、更适于工业化大规模生产的培养方法。 （1）微载体培养（microcarier culture) （2）包埋和微囊培养 （3）结团培养 （1）微载体培养 微载体培养是以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。 优点：兼具悬浮培养和贴壁培养的一切优点，放大容易，应用广泛。 微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。目前国际市场上出售的微载体商品类型已达十几种以上。例如液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体 。常用的微载体基质包括葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类等等。 显微镜下的微载体 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特种橡胶、玻璃、陶瓷…… 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清洗较困难。 理想的微载体需具备的一些条件： 微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸展和增殖。 微载体的材料无毒性。 微载体的材料是惰性的。 微载体的比重为1.030～1.045g/ml，在低速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获。 粒径在60 ～250μm之间，并要尽可能地均一，有利于细胞均匀地分布于其表面。 具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察。 基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载体互相摩擦而损伤细胞 可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌 经简单的适当处理后，可反复使用。 原料充分，制作简便，价廉。 （2）包埋和微囊培养 包埋培养是将细胞包埋或包裹在凝胶载体内或微囊内进行培养的一种技术，有时又称之为巨载体（macrocarrier)培养. 微囊培养由包埋培养衍生而来，即将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊。 可用于包埋细胞的载体材料大致有3类：①人工合成的高分子聚全物；②糖类，如纤维素、琼脂、琼脂糖、K-卡拉胶、海藻酸钙、脱乙酰几丁质等；③蛋白质，如胶原、明胶、纤维蛋白等。 微囊膜的制备则通常采用海藻酸钠—聚赖氨酸系统。 包埋或微囊培养法的优点是： 细胞可获得保护，避免了剪切力的损害。 可以获得较高的细胞密度，一般都在107～108个/ml以上。 当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓宿在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。 可采用多种生物反应器进行大规模培养：搅拌罐式生物反应器、气升式反应器、固定床式生物反应器等等。 （3）结团培养 用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养的一种细胞贴附—悬浮培养技术。 在实际使用中，为了加速细胞的结团，可先在培养基内加入一些直径较小的微粒（20μm）。此法与微载体培养的不同是：用量小，细胞不能在载体上伸展，细胞呈球形。 该培养方法的优点：操作简便，节省了用于微载体的成本。 动物细胞固定化各种方法的特点 第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式二、动物细胞培养的操作方式 细胞培养方式一般可分为分批式操作、补料-分批操作（流加式）、半连续式操作、连续式操作和灌流式操