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紫外可见分光光度法测定溶液中的蛋白质
紫外分光度法测定蛋白质的含量
目的：
1、了解紫外分光光度计的组成与结构
2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质的原理和方法
3、熟悉紫外分光光度法的实验技术
原理：
蛋白质分子结构中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，具有吸收紫外光的性质，其最大吸收波长为280nm左右，在一定实验条件下，蛋白质溶液的吸光度与其浓度符合朗伯比尔定律，据此可对蛋白质进行定量分析。
仪器与试剂：
1、紫外可见分光光度计
2、石英比色皿，胶头滴管，比色管，烧杯，容量瓶
3、生理盐水，蛋白质标准溶液，未知蛋白质溶液
实验步骤
1、吸收光谱曲线的绘制 以生理盐水作参比，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，从200-400nm扫描牛血清白蛋白的吸收曲线并找出最大吸收波长。
2、准确移取5.00mg/ml牛血清白蛋白标准应用液0.00、0.50、1.00.、1.50、2.00ml，分别置于10ml比色管中，用生理盐水稀释至刻度，摇匀，以生理盐水作参比，绘制标准曲线
3、测定未知蛋白溶液
准确移取血清样本0.1ml，置于10ml比色管中，定容至刻度，以生理盐水作参比，在最大吸收波长下测定。
实验结果
标准1 标准2 标准3 标准4 标准5 浓度mg/ml 0 0.25 0.50 0.75 1,00 吸光度值A 0.056 0.300 0.567 0.813 1.065
样品连续测量3次结果分别为：
A=0.951 A=0.951 A=0.973
C=C稀释倍数=89.36mg/ml
讨论
1、由于蛋白质的紫外吸收峰常因溶液ph的改变而改变，测定时未知溶液与标准溶液的ph要一致。
2、紫外风光光度法测定蛋白质的准确度较差，其主要原因为不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，使得不同蛋白质溶液在280nm的吸收系数也不同，样品中若含有核酸，可分别测定280和260nm的吸光度值，用经验校正公式计算蛋白质的浓度
蛋白质浓度=1.45
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