细胞工程实验-动物细胞原代培养及观察.docVIP

实验三 动物细胞原代培养及观察 一、实验目的 1.学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法。 2.学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法。 二、实验原理 原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。 原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。 原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。是常用的、简便易行和成功率较高的方法。依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。本实验采用翻转干涸法。酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。 三、主要仪器与试剂 1.实验仪器：培养瓶、培养皿、剪子和镊子、青霉素小瓶、滴管、移液管若干、冻存管、乳胶头 2.实验试剂及材料：PBS、 MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）、泥鳅 四、实验步骤 （一）材料的预处理 1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。 2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。 3.将实验用泥鳅放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。 4.用纱布包裹住将泥鳅取出，将其击昏。 （二）原代培养 1.将欲取材部位如心脏、鳍、肝脏、肌肉等剪下，放入已灭菌的培养皿中。 2. 用75%酒精漂洗一次后，去除皮下脂肪和结缔组织。 3. 加入PBS缓冲液漂洗三次，以去掉表面血污。 4. 将组织块放入已灭菌的青霉素小瓶中，加MEM0.5～0.8ml (加入前移液管过火焰)。 5. 将眼科剪用酒精棉擦拭后过火焰。 6. 左手斜持小瓶，右手将眼科剪伸入小瓶中，反复剪切成1mm左右的小块。 7. 剪碎后，将瓶微倾斜，静止片刻，用吸管吸除上清液。 8. 用1mlMEM进行漂洗，轻摇后(幅度要小，在液体高度范围内，以下同)，微倾斜，静止片刻，用吸管吸除上清液。加入0.5ml MEM，轻轻摇匀。 9. 准备好一个培养瓶，在瓶侧写上标记。 10. 用吸管将组织小块转移铺展至培养瓶中（从里向外“之”字形划行移动,边移动边放液）。 11. 微侧培养瓶，用吸管吸出清液，盖好瓶盖，放置1～2分钟，轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上。 12. 保持瓶底向上，打开瓶盖，加入3ml MEM，瓶口及瓶盖过火焰后盖紧。 13. 瓶底向上静置2~4小时，再轻轻将培养瓶翻转过来进行培养，翻转时，要先竖起，再慢慢平放，使培养液缓缓浸没组织块。 14. 将培养瓶放入25度的培养箱中培养。 五、实验结果 组织被污染。污染的可能原因：①实验使用的仪器消毒不彻底；②对实验操作不熟悉导致的延迟，增加了暴露在空气中的时间；③培养基灭菌不彻底或因前组同学使用时的不注意导致污染。 六、思考题 1.绘图说明动物细胞原代培养的结果与分析 实际培养的细胞被污染，拿到的是老师培养的细胞。 图中所示细胞数量较多，但仍处于对数生长期，尚未产生接触抑制。 2.动物细胞培养液的种类和主要成分 动物细胞培养基一般是液体培养基。根据其是否能促进细胞生长，可分为生长培养基、维持培养基；根据其成分来源，可分为合成培养基、天然培养基；根据目的分为鉴别培养基、选择培养基；根据培养基状态分为液体培养基、琼脂培养基。 培养动物细胞用的生长培养基组分包括9种：水、无机盐、微量元素、维生素、缓冲系统、能源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂等。对动物细胞来说，一般只要将生长培养基中的血清浓度降低或全部除去，就可获得维持培养基。 2