分子生物学操作基本技术程序介绍.ppt

取出感受态细胞，（如果在-70℃冰箱中，需要将管握于手心，融化细胞），每管200μl,立即将eppendorf离心管放到冰浴中，放置10min； 将待转化的DNA加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次，混匀内容物，冰上放置30min；（DNA量不应超过感受态细胞体积的5%）； 冰上放置20～30min，然后42℃水浴热激90Sec，迅速冰上冷却2min； 立即向上述Ep管中加入0.8mL LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约15～30min ，使受体菌恢复正常生长状态及表达抗性基因； 5、取培养液50μL接种于含抗生素的LB平板培养基上，用玻璃涂棒涂匀；（或浓缩后涂布，留下1/10备用） 6、将培养皿放在37℃恒温培养箱培养30 min,待菌液完全被培养基吸收后（无菌风吹干），倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(14-16h) 。 ?－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－?－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ基因的失活，，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 蓝白斑筛选： 转化子筛选策略：LB+Cm+Ga（双抗平板） Pseudomonas putida Cm + E.coli /pJQ200gbtAB Ga + E.coli /pRK2013 Str + ，Kan +,辅助质粒 双亲接合和三亲接合 Pseudomonas putida KT2440 Cm + E.coli /pBBRMCS5 Ga + 转化子筛选策略：LB+Cm+Ga（双抗平板） 有时，抗生素浓度的选择有时也很关键 Pseudomonas putida KT2440 Cm + E.coli /pSC123 Kan+ + Cm + 转化子筛选策略：MM(琥珀酸钠为碳源)+Cm+Kan THANK YOU ! * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 三 细菌基因转移的方式 细菌的三种水平基因转移形式 接合 转导 转化 接合 (conjugation)： 细胞与细胞的直接接触（由F因子介导） 转导(transduction)： 由噬菌体作为载体介导 转化(transformation)： 游离DNA分子 + 感受态细胞 （一） 细菌的遗传转化（genetic transformation） 定义：游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。 1、转化 1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象 目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力 进行转化，需要二方面必要的条件： 受体细胞处于感受态：最容易接受外源DNA的一种生理状态。 转化因子：外源游离dsDNA分子 以革兰氏阳性的肺炎双球菌为材料，其转化过程大体是： 1、双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合。 2、在位点上的DNA发生酶促分解，形成平均分子量为（4~5) x 106D的DNA片段。 3、 DNA双链中的一条单链逐步降解，同时，另一条单链逐步进入细胞。 4、 转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，于是形成了杂种DNA区段。 5、受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。 转化全过程 转化整合过程 转化过程的特点： a）对核酸酶敏感； c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于 转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的 亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率低 b）不需要活的DNA供体细胞； 人工转化 用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。 在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。 用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。 （二） 细菌的转导（transduction） 由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式： 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA 带到另一个细菌的