01 蛋白质的结构与功能(本 6).ppt

五、蛋白质的紫外吸收和呈色反应 含共轭双键的aa（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）最大吸收峰：280nm （一）蛋白质的紫外吸收性质 280nm 275nm 257nm 蛋白质溶液的最大吸收峰：280nm 在碱性条件下，蛋白质分子内的肽键可与Cu2+作用生成紫红色络合盐。 应用： - 蛋白质、多肽的定量测定 - 检测蛋白质的水解程度（aa无此反应） 肽键及特殊基团可与有关试剂发生呈色反应。 1. 双缩脲反应 （二）蛋白质的呈色反应 p33 2. 茚三酮反应 在pH5～7的溶液中，蛋白质游离?-氨基与茚三酮反应生成蓝紫色化合物。 应用：蛋白质的定性、定量测定。 3. 酚试剂反应 在碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸可与酚试剂（磷钨酸与磷钼酸）反应生成蓝色化合物。 应用：蛋白质的定性、定量测定。 　　 灵敏度比双缩脲反应高100倍。 第六节 蛋白质的一级结构测定 一、样品的纯度要求 大小均一、电泳单一条带、比活性恒定、能够结晶 杂蛋白＜5%，电泳估测分子量 二、氨基酸组成分析 蛋白质经酸（常用）、碱、酶水解后 分析多肽链中氨基酸的种类和含量 p34 蛋白质测序、DNA序列推演aa顺序、串联质谱技术 三、多肽链的末端分析和序列测定 （一）N端分析和序列测定 1. 2,4-二硝基氟苯（FDNB）法 利用FDNB与肽链游离-NH2生成 2,4-二硝基苯（DNP）-多肽， 酸水解后鉴定DNP-氨基酸衍生物即可知N端aa p34 2. 丹磺酰氯法 二甲氨萘磺酰氯（丹磺酰氯，DNS-Cl） 专一结合N端α-NH2，酸性条件下乙酸乙酯抽提并鉴定 紫外光激发产生黄色荧光，灵敏度较FDNB法高100倍 p35 3. Edman降解法 用苯异硫氰酸（PITC）弱碱性条件下标记肽链N端α-NH2，生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-多肽）。后者再在酸性介质中环化裂解，生成乙內酰苯硫脲氨基酸（PTH-aa）和少了N端aa的多肽。PTH-aa用乙酸乙酯抽提分离鉴定可知aa种类。经重复标记、环化裂解、转化、分离、鉴定……可分析约50个aa残基的多肽。 p35 （二）C端测定 羧基肽酶A、B、C、Y 专一性各不相同 p36 四、二硫键的拆开 （一）过甲酸氧化法 生成2个半胱磺酸，但会破坏Met、Trp （二）巯基化合物还原法 β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）， 需碘乙酸使半胱氨酸-SH转变为乙酰半胱氨酸 p36 五、肽链的部分水解 将长的肽链用酶法或化学法，切成一套特异性片段； 分离、纯化每个片段； Edman程序测定每个片段的序列； 排列这些片段并安排二硫键的位置。 p37 六、完整多肽链顺序的确定 p38 用2种以上方法裂解成几组肽段，并测定每个肽段的aa排列顺序，用肽段重叠法确定整个肽链的aa排列顺序。 七、二硫键的定位 另取一份蛋白质样品，用同样的酶水解，但不要预先拆开二硫键。肽段分离后电泳，与预先拆开二硫键的结果对比，两个原来的肽段将消失而出现一个新的、大的片段。那两个消失的肽段代表在完整肽链中被二硫键连接的区域。 （一）名词 蛋白质等电点；蛋白质变性； 蛋白质一级结构（二、三、四） （二）简答 1、简述蛋白质变性的概念及其应用举例。 2、简述蛋白质一级结构（二、三、四）稳定 的主要维系键。 3、简述蛋白质二级结构的四种形式。 本章作业 * 镰刀状红细胞性贫血 病症 受影响的蛋白质 Lesch-Nyhan综合征 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 免疫缺陷病 嘌呤核苷酸磷酸化酶 ADA缺陷病 腺苷酸脱氨酶 Gaucher病 葡萄糖脑苷脂酶 通风 磷酸核糖焦磷酸合成酶 维生素D依赖性佝偻病 25-（OH）-D3-1-羟化酶 家族性高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体 泰萨氏幼年型黑白痴病（Tey-Sachs病） 氨基己糖苷酶A 镰状细胞贫血 血红蛋白 同型半胱氨酸尿症 胱硫醚合成酶 白化病 酪氨酸酶 蚕豆病 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 肝豆状核变性 血浆蛋白 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 几乎所有遗传病都与正常蛋白质的分子结构改变有关 二、蛋白质的空间结构与功能的关系 血红蛋白（Hb）变构引起功能改变 ?亚基 血红素（Fe2+） ?亚基 与氧可逆结合 p24 紧张态(tense state，T态) 未结合O2时，紧凑，与O2亲和力小 机制：?1:Tyr(42) →?2:Asp(99) 形成氢键 松弛态(relaxed state，R态) 结合O2时，松弛，与O2亲和力大 机制：O2结