生物技术大实验十四组重点.pptVIP

生物技术大实验 十四组 组员：1031001 刘霖 1031023陈志婷 1031046黄一淳 1031048陆杨丽 1031072 龙晶 实验内容 1.器具洗消、高压灭菌、基本试剂配制 2. PCR扩增 3.产物的电泳和结果的测定 一、材料 1、模板、引物 cDNA、引物3、4 2、试剂 LB琼脂、LB肉汤、氨苄青霉素、TBE、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、PCR试剂盒及产物回收试剂盒 3、器材 PCR仪，电泳仪，微量可调加样器(1000、200、100、10uL)各一支，配套相应的枪头，EP管（1.5mL；0.5mL)，锥形瓶，15ml试管，凝胶成像分析仪，超净工作台，小型离心机，一次性薄膜手套 二、方法 1、PCR扩增纯化目的基因 1.1 取1支0.2ml的PCR管，在冰上依次加入： 1.2 PCR反应条件（热盖打开到99℃）： 1.3 胶回收 2、连接到T-easy载体中 1）快速链接反应： 反应按一下体系进行： 5μL 2×Quick Ligation Buffer 1μL PBLUE-T 载体 XμL 纯化后的PCR产物/或者1μL 1000bp control YμL 无菌水 1μL (5 weiss Units/μL) T4 DNA Ligase Final Volume 10μL 2）16℃链接30min 3）冰上冷却，然后转化或贮存于﹣20℃ 3、转化感受态细菌 3.1 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种 于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右后， 扩大培养 3.2 感受态细胞的制备 ⑴取2ml大肠杆菌培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10 min。 ⑵弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g离心10分钟。 ⑶弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 3.3 转化 ⑴取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上； ⑵加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30min ； ⑶42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5min ； ⑷向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。 4、平板培养 取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放 置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培 养16-24h。 5、挑选单克隆，进行液体培养和PCR鉴定阳性克隆 找出白色的单个菌落用牙签挑出半个菌落放入液体培 养基中进行摇菌培养12h，余下的半个菌落当模板进行 PCR，用PCR产物跑电泳 6、质粒小抽 四、分析 CHMP4b长675bp的DNA序列，在用cDNA做模板、用3,4做引物做PCR时，PCR产物跑电泳时目的条带在500-700之间，而675刚好也是在500-700之间。目 的基因链接并转接到处于感受态的大肠杆 菌后进行质粒抽提、然后做PCR、跑电泳 得出的条带也在500-700之间 。 五、讨论 经过一个多月的实验，我们重温了基础的实验操作，自己的实验操作技能在一定程度上得到提升。通过这次试验，我们得出以下经验教训： 1、实验都要有一定的理论基础，弄清楚实验目的，理解实验原理，熟悉实验步骤是实验必备的。我们要主动搜集相关资料，对实验有更深的了解，才能使实验得以顺利进行。 * 2μl 模板cDNA 1μl 下游引物 1μl 上游引物 10μl 2×PCR master mix 6μl ddH20 体积 组成 总体积 20μl 加完样后，混匀快速离心一次(可以将PCR管子放入剪去盖子的1.5ml离心管中)，3000rpm离心10s。 5min 72℃延伸 90s 72℃延伸 30s 共35个循环 57℃退火 30s 94℃