酶法分析(生科院2015).pptVIP

（二）应用范围 1.有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定NAD、NADP、CoA等 2. 能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶 可测定 “酶法分析”一章的要求 1 掌握终点法的测定原理，终点法的条件 2 使用终点法测定时应注意的问题 3 掌握通过测定辅酶变化量的单酶反应定量法（学会如何进行实验设计和分析） 4 掌握以脱氢酶为指示剂的偶联定量法（学会如何进行实验设计和分析） 5 掌握酶循环放大分析的原理和步骤 6 使用循环放大分析法时应注意的问题 7掌握循环放大分析法的应用（学会如何进行实验设计和分析） 反应速度法 辅酶的测定 抑制剂的测定 S E P 抑制剂 抑制剂的量与反应速度的下降值成正比 例：肝素的测定 RNA 小分子 RNAse 肝素 紫外有吸收 无 肝素的量与反应速度的下降值（V= ΔA/ Δt）成正比 标准曲线 样品的测定 管号 0 1 2 3 4 5 1 2 标准肝素溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 待测样品(ml) 1.0 1.0 H2O(ml) 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1.0 1.0 RNA(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 RNAse(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 连续测定各管A300值，求出各管ΔA300=0.04所需的时间Δt Δt0 Δt1 Δt2 Δt3 Δt4 Δt5 Δt测1 Δt测2 标准曲线法 根据 Δt测/Δt0计算样品中肝素含量 酶法分析 是利用酶作为工具对特定物质（底物、辅酶、抑制剂和激动剂等）进行定量分析的方法。 酶法分析与酶活力测定的异同 相同点：二者均使用了酶促反应 不同点： 测定的目的物不同，实验设计不同 酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须 是限速因素，而底物和辅酶等必须过量； 酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。因而必须使待测物成为该反应的限速因素。 因此二者是不相同的，不能混为一谈。 终点法(总变量法 ) 终点法是以下述原理为基础的： 先借助酶反应（单个酶反应或者几种酶构成的偶联酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转变完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量，因此称为终点测定法。终点法是酶法分析中最普遍，最广泛的定量法。 终点法的条件 必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。 能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。 反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定。 在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。 使用终点法应注意的问题 1．酶的底物专一性： 绝对专一性 相对专一性 立体异构专一性 对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。 2．反应的平衡 对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。 若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。 若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完全，因而也就不能正常定量。为了解决这一问题，通常采取以下一些措施： 对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度 对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH 设法除去产物 用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶 和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物 3．反应液中的酶量 对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论： 对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当于Km（mmol） 对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下： 第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol） 第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol） 4.反应产物抑制 终点法的种类 （一）单酶反应定量法： 在这种单酶反应中，不需指示反应，可以直接测定S的减少量或P的增加量和辅酶的变化量。 1、底物减少量的测定 可定量的物质有：胞嘧啶（280nm）、腺嘌呤（280nm）和尿酸（293nm或297nm）。 尿酸的定量 2.产物增加量的测定 此法可定量的物质有： （1）各种氨基酸和草酸 （2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA 3.辅酶变化量的测定 条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量，此法适用范围很广。 原理：NADH和NADPH在340nm有特