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狂犬病实验室检测技术 一、实验室操作前的要求及准备 二、实验室检测方法 实验室操作前的要求及准备 (一)实验室条件及生物安全操作要求 (二)检测标本的要求 (三)实验前准备 (一)实验室条件及生物安全操作要求 1、暴露前免疫 工作人员需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。 2、P2实验室 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行 (实验室固定毒在P2,病人或动物分离的街毒在P3)。 3、P3实验室 对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3 以上条件的专业实验室中进行。 没有P3 实验室,严禁从事狂犬病毒分离工作。 4、个人防护 实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套, 作好技术上的准备。 5、防止气溶胶扩散 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实,因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。 6、实验后消毒处理 实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂(肥皂水、醚、氯仿、丙酮),45~70%乙醇,碘制剂和四铵化合物敏感,操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。 1、采集时间 (1)应尽量采集较新鲜的标本。 (2)采集时无菌操作,避免标本污染 2、标本保存 (1)尽量低温保存 (2)存放于无菌离心管中并进行编号。 3、标本类型 (1)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。 (2)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于 病原学检测,其中以脑组织中的阳性率最高; 血清和脑脊液可用于抗体的检测。 (三)实验前准备 1、实验室及仪器的准备(略) 2、各种试剂及材料的准备(略) 实验室检测方法 (一)DFA 法 (二)巢式 PCR 法 (三)其它检测方法 (四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法 (五)美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法 (一)DFA 法(直接荧光抗体法) ——检测狂犬病毒抗原 荧光抗体的染色方法可分为两类: 直接法 — 荧光抗体直接与标本内的抗原反应, 优点简便、快捷、有效减少非特异性染色, 只适用于检测细胞内的抗原; 间接法 — 荧光抗体作为第二抗体,与直接结合胞内抗原的第一抗体反应, 既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体 相对直接法操作步骤增多 DFA原理: 抗体蛋白分子 + + 抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原 荧光素 操 作: 1、材料和仪器 2、操作步骤 i. 印片: 用酒精浸泡载玻片 30 分钟后取出、吹干, 分别取不同部位的脑组织剖面, 均匀的涂印在载玻片上; ii. 固定: 吹干后,取冷丙酮(4℃)室温固定 7~10 分钟; 取出吹干,进行步骤3,或置于- 70℃冰箱保存; iii. 加荧光抗体: 将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上 (如果从 冰箱中取出,则待雾气散掉后再进行此步骤。); iv. 孵育: 将抗原片放在湿盒中, 37℃温育30 分钟; v. 洗片: 取出后,用缓流冲洗抗原片 3~5 秒, 再用 PBS 振洗 2 遍, 蒸馏水振洗 1遍,每次 2 分钟,吹干; vi. 封片镜检: 用 90%甘油( PBS)封片,加盖玻片,荧光显微镜观察。 结果判断: 仔细观察每个视野的荧光强度,并结合不同视野 的荧光分布,作出荧光强度的等级判断:阴性、可疑、 +~ ++++ -:无荧光; +/-:极弱的可疑荧光; +:荧光较弱,但清晰可见; ++:荧光明亮,且多个视野均有分布; +++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛; (二)巢式 PCR 方法——检测狂犬病毒核酸 传统的 PCR 检测模式一般需要三个步骤: 制备模板:对待测标本进行核酸(DNA或 RNA)提取 扩增过程:采用
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