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了解黄芪注射液对内皮细胞损伤的保护作用及其机制实用肝脏病杂志 网址：/a/sf/0502120J2012.html 　　近年来研究证明，血管内皮细胞损伤是多种心血管疾病的共同病理生理学基础，是动脉粥样硬化的始动环节。有效保护血管内皮细胞是预防和治疗心血管疾病的关键。黄芪注射液是由豆科植物黄芪提取制成的灭菌水溶液，主要含有黄酮、皂甙、多糖等多种活性成分，有补气升阳、利水消肿、益气固表之功效，因此在心血管疾病防治方面应用广泛。近来研究发现，黄芪对动脉粥样硬化性疾病有一定 的疗效。但因证据多来自临床试验或活体动物研究，且缺乏黄芪在细胞水平上对血管内皮作用的研究报道，故其治疗动脉粥样硬化性疾病的具体机制尚未完全明了。本研究采用血管内皮细胞低氧复氧模型，观察黄芪注射液对血管内皮细胞损伤的作用及机制，以期为临床用药提供依据。现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料及其来源DMEM 培养基， GIBCO 公司生产。 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所生产。黄芪注射液，成都地奥九泓制药厂生产，批号:0106125。MCO-17AIC型二氧化碳培养箱，日本Sanyo公司生产。CK2型倒置相差显微镜，日本Olympus公司生产。 　　1.2 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）原代培养 在无菌条件下取健康产妇正常分娩胎儿脐带25～30 cm，用Hank液冲洗干净，灌入1 g/L的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃温箱中培养18～20 min，收集消化液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含体积分数0.20小牛血清和生长因子的DMEM培养液制成细胞悬液，置37 ℃、含体积分数0.05 CO2 培养箱中培养，24 h换液，待细胞长成融合状态后行细胞鉴定。血管内皮细胞特征:相差显微镜下呈单层铺路石样排列，用免疫法测定第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。确定为内皮细胞后再传代培养，取第3代生长良好的血管内皮细胞用于实验。 　　1.3 低氧复氧模型的制备 将培养有内皮细胞的24孔培养板放入一可密闭容器中，向该容器内持续通入低氧混合气体（含体积分数0.05 CO2 、体积分数0.95 N2 ）5 L/min，置换容器中的氧气。待该容器内氧气体积分数低于 0.01后 ，停止通入低氧混合气体。密闭该容器，置于37 ℃细胞培养箱中培养1 h，再打开容器，将24孔培养板置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2 培养箱进行复氧处理1 h。 　　 　　1.4 实验分组 实验共分3组，每组6例。①对照组:置于 37 ℃ 含体积分数0.05 CO 2 培养箱中进行常规培养;②低氧复氧组:制备低氧复氧模型;③药物干预组:又分5个浓度组，每组6例，在培养液中分别加入终浓度为5、10、20、40、60 mg/L的黄芪注射液，预处理12 h，然后同低氧复氧组处理。 　　1.5 检测指标及方法 　　1.5.1乳酸脱氢酶（LDH）、SOD活性和MDA含量的测定 收集各组培养细胞上清液，按每份1 mL分装，置-70 ℃冻存备用。LDH、SOD和MDA测定分别用全自动生化分析仪、黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥法，具体测定步骤按仪器和试剂盒说明书进行。 　　1.5.2台盼蓝摄取率测定 提取完上清液后，将各组多孔板中的液体弃去，用25 g/L胰蛋白酶消化内皮细胞后，再加入含体积分数0.20小牛血清的 DMEM培养液，制成细胞悬液，细胞悬液和40 g/L台盼蓝混合（9∶1），4 min后计数蓝染细胞和未蓝染细胞。计算台盼蓝摄取率。台盼蓝摄取率=蓝染细胞数÷（蓝染细胞数+未蓝染细胞数）×100%。 　2 结果 　　低氧复氧组与对照组比较，细胞培养液中LDH活性、MDA含量及内皮细胞台盼蓝摄取率升高，SOD活性减低，差异均有显著意义（ F=34.97～ 129.98 ，q=14.43～27.11，P 0.01）。药物干预组与低氧复氧组相比较，细胞培养液中LDH活性、MDA含量及内皮细胞台盼蓝摄取率降低，SOD活性升高，差异均有显著意义（ q=2.91～26.61，P 0.05、0.01 ）。黄芪注射液预处理浓度40 mg/L时LDH活性、SOD活性、MDA含量与对照组差异无显著性（ q= 0.49～0.94，P 0.05）;预处理浓度 60 mg/ L与40 mg/L相比，LDH活性、SOD活性、MDA含量变化均不明显。 　　3 讨论 血管内皮位于血液与血管壁的界面，直接受到血液中各种理化因子的刺激，同时，内皮细胞本身是高代谢、多功能细胞，对刺激的敏感性高，因而最易被损伤。氧化应激，即活性氧蓄积引起的脂质过氧化是内皮细胞损伤的一个重要机制。活性氧的氧化能力极强，易与细胞膜及亚细胞膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，