第五章酶分子的化学修饰：教材.doc

第五章 酶分子的化学修饰： 自然界本身就存在着酶分子改造修饰过程,如酶原激活、可逆共价调节等。 非共价修饰： 添加剂；甘油、多糖、聚乙二醇等多羟基化合物 表面活性剂，牛乳过氧化物酶活力在3-4天完全丧失，添加表面活性剂B2，维持获利10天上； 蛋白质间的非共价连接 α-淀粉酶70℃半衰期5民，抗体保护，16h. 从广义上说，凡通过化学基团的引入或除去．而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为酶的化学修饰。 从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。 50年代，化学修饰用于研究蛋白质结构和功能的关系。为了考察蛋白质中氨基酸残基的各种不同状态和确定哪些残基处于活性部位并为蛋白质的特定功能所必需。 20世纪70年代末以来,有关用合成高分子如聚乙二醇(ＰＥＧ)及其衍生物进行蛋白质化学修饰，目的是用于生物医学和生物技术方面。 意义： 基础酶学的研究； 活性部位的研究 氨基酸顺序分析中，胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性,故常用此酶水解蛋白质,以制备肽碎片.为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题,可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸,使水解局限在其中一个残基的肽键上； 测定酶分子中某种氨基酸的数量。 探索酶的作用机理和催化反应历程 提高生物活性(包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变)； 增强在不良环境中的稳定性； 针对特异性反应降低生物识别能力．解除免疫原性； 产生新的催化能力。 第一节酶分子的修饰方法 一、酶的表面修饰 （一）小分子修饰：利用小分子化合物对酶的侧链基团进行化学反应 在蛋白质结构与稳定性的关系的研究中发现蛋白质结构对稳定性而言并非最合适的，蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸组成,蛋白球体的非极性表面原子簇与水接触不利于酶的稳定.因此,利用小分子化合物使蛋白球表面亲水化以提高酶的稳定性。 酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基等 乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等2.N-羟基琥珀酰亚胺法 右旋糖苷修饰α-淀粉酶：60℃,t1/2：3.5min；修饰后：175℃ 天然过氧化氢酶在6h内很快从血液中出去，PEG修饰后，酶活力在血液循环中可保持72h MPEG修饰过氧化氢酶，有机溶液中的溶解性和酶活提高，三氯乙烷中酶活是原来的200倍，水溶液中为原来的15-20倍。 稳定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性与抗原性降低、延长半衰期。 （三）交联修饰 使用双功能或多功能试剂如戊二醛等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联。 枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体，其酶活提高13倍。 葡聚糖二乙醛交联青霉素G酰化酶，55℃下的半衰期提高9倍。 可使酶分子活性结构加固．井可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。 （四）固定化修饰 二、酶分子的内部修饰 非催化活性基团的修饰 改变酶的动力学特征、改变酶对特殊底物的束缚能力。 胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亚砜，该酶对含芳香族或大体积脂肪族的专一性底物的Km提高2-3倍。 蛋白质主链的修饰 猪胰岛素B链的丙氨酸 天冬氨酸有限水解切去10个氨基酸后，酶活提高5.5倍 类蛋白的合成 蛋白分解产物(小肽或低分子蛋白)可以在一定条件下重新组合生成类蛋白。 水解反应能改进热变性蛋白质的溶解性,也有助于分解和除去杂质，除臭，脱色，提高风味。 改善氨基酸组成；提高营养价值。导入蛋白质中缺乏的某些必须氨基酸。 提高蛋白食品的功能性质。凝胶性，起泡性，乳化性、稳定性等。 催化活性基团的修饰 蛋白质工程 化学突变：将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法。 枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser转化为半胱氨酸，对肽或酯无水解能力但保留或酯水解能力。 转化为硒代半胱氨酸。酰基转移酶及氧化还原酶的活力。 肽链伸展后的修饰 脲及盐酸胍处理，酶处于肽链充分伸展，提供了化学修饰内部基团的可能性。修饰后，适当条件下，重新折叠。 与辅因子相关的修饰 1．依赖辅助因子的酶 辅因子共价结合在酶上 NAD共价结合到醇脱氢酶，活力为原来的40%,但解决了辅因子循环利用的问题。 引入新的或修饰过的具有强反应的辅因子 许多酶含有辅酶或辅基，是酶的活性基团。由于种类有限，限制了酶的功能。修饰辅因子，可创造出多种多样的新酶。 1988年Kaiser将黄素共结合在木瓜蛋白酶上,从而将蛋白酶转变成氧化原酶。 2.．金属酶中的金属取代 酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。 用钴取代羧肽酶活性必需的锌，结果肽酶活性和酯酶活性都升高；但如用锰或镉取代锌时，其肽酶活性升高，酯酶活性却下降。 酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌