2016 第3周 实验1农杆菌介导拟南芥转化-II.pptVIP

发育生物学实验 主讲教师：薛秀花 北京师范大学生命科学学院2016年 一、拟南芥简介 二、实验技术---农杆菌介导拟南芥转化 实验1 拟南芥室内培养观察及 农杆菌转化拟南芥 农杆菌介导拟南芥的转化 实验目的 1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理 2、掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法 3、了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。 实验材料 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300 ，拟南芥 实验试剂 LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； 转化介质 ：MS培养基、5%蔗糖，0.03%SilwetL-77，KOH调pH 5.7。 实验原理 双子叶植物 无宿主限制，技术限制 原生质体培养 农杆菌介导拟南芥的转化 浸花法 叶盘法 原生质体共培养 创伤植物感染法 实验原理 农杆菌介导拟南芥的转化 农杆菌的感染与生存 技术应用 一种方便，高效的植物转基因方法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也逐渐用于单子叶植物的转化。 实验原理 农杆菌介导拟南芥的转化 McKinney et al 2001 拟南芥转基因技术： In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C R Acad Sci Ser III Sci Vie Life Sci 1、影响因素 MS salts, hormone, OD of bacteria, vacuum, etc. 无影响 Plant health 非常重要因素 2、转化效率： 1% 3、转化步骤 a、Grow healthy Arabidopsis plants until they are flowering. 8、高压灭菌 （1） MS培养基（121oC,15分钟）。 （2）玻璃烧杯：200ml 2个、500ml 1个、 50ml的三角瓶 20个、培养皿8个（ 4培养皿装滤纸，6片/平皿）。 （3）枪型镊子、剪刀各2把。 （4）1ml、200ul、20ul的tip头各1盒。 (5)无菌水500～700mL*2 拟南芥转基因技术： McKinney et al 2001 1、影响因素 MS salts, hormone, OD of bacteria etc. 2、 3、 4、 作 业 预习：烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生 课后各组查阅资料，设计3个不同浓度的NAA和6-BA，用于诱导不同器官，如芽、根、叶等