固定化技术讲述.pptVIP

交联法： 利用双功能或者多功能试剂在酶分子之间或者载体之间；酶分子与载体之间进行交联反应而固定化。通常用戊二醛。 OHC-(CH2)3-CHO+E-----CH=N-E–N==CH-(CH2)3-CH==N-E-+CH- ? N N ‖ ‖ CH CH 戊二醛属于同型，还有异型：甲苯-2-异氰-4- 异硫氰交联可以在分子内，也可以在酶分子之间， 这是与酶量有关的一个问题。 酶浓度低时，交联发生在分子内, 酶浓度高时，交联发生在分子间， 固定化后，酶与载体成为不溶态的颗粒。 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。 克服的方法： 1）酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊 内，再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒。 2）酶先在硫酸胺或者丙酮中沉淀，再交联。 实验方法上的要点： 1)交联条件激烈，需要保护性措施。 2)交联剂的链长和功能基团的选择问题。 只要选择适当,有利于建立某些分子内交联,亚基固定和四级结构维持,增加酶的稳定性。但链过长，疏水性升高，对固定化酶有害。 包埋法： 将聚合物单体和酶溶液混合后，再用聚合促进剂(包括交联剂)的作用而聚合，酶就包埋在载体中达到固定化。酶本身不参与反应，所以较安全。 但在聚合过程中有自由基产生及聚合时放出热，酶与试剂可能发生化学反应，这些因素可能会使酶失效，或者降低酶活性。操作时注意条件的控制。 1）格型包埋 常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。 先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。 优点: 1.包埋容量10-100毫克蛋白/克单体。 2.改变单体与交联剂比例,控制凝胶孔径的分布,改善酶的持留与底物和产物扩散转移状况。 3.改变单体性质,可调整固定化酶的亲水和亲脂特性。 缺点:1.孔径过大,有酶的丢失现象,这时可以提高单 体浓度 达到部分解决。 ?????? 2.单体15%,丙烯酰胺自身会导致酶失活。 可采用包埋和共价偶联结合。 3.有自由基产生，聚合时会放热， 例子： 如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和丙烯酸中，然后再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。 2)微囊型包埋 常用的微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、醋酸纤维素等。 主要是直径为几十到几百微米的球状体，其颗粒要比网格型小的多。因采用高分子半透膜将酶包埋固定化。半透膜容许小分子底物和产物自由出入微囊的内外，囊的表面积相对体积的比值大，底物和产物的交换进行迅速。该法适宜底物和产物均是小分子物质的酶的固定化。 （1）界面沉淀法：例子：尼龙膜界面聚合包埋 (酶+己二胺水溶液）+庚二酰氯有机溶剂（氯仿） ? 混合? 乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯)在水相、有机相交界处聚合 ? 形成包埋酶的尼龙膜珠粒 ?  Tween 20破乳化,得到微囊包埋酶 破乳：是在乳化剂的帮助下，使包埋了的酶从有机相移入水相。该法条件温和、酶失活少，但完全除去膜珠上的有机溶剂较难。 （2）界面凝聚法： 硝酸纤维素：高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极度下降而凝固、聚合形成皮膜将酶固定化。 酶水溶液 + 硝酸纤维素 ? 乳化分散,加苯甲酸丁酯,使纤维素在酶周围凝聚， ? Tween 20乳化后得到火棉胶微囊。 如蔗糖酶可以达到1500mg/g聚合物。 优点： 1）纤维表面积和重量比值高 2) 凝聚后酶稳定性好 3) 包埋量大 （3）脂质体包埋 如：胆碱-Ser + 卵磷脂—胆固醇 ? 一定比例混合 ? 直接喷入酶溶液或在瓶的壁形成膜,再加入酶溶液 ? 二相迅速混合时自己形成脂质体表面。 优点： 1.具有一定强度 2.可以专一性地将酶带到体内特定部位，再释放酶 3.脂质体可和某些如抗体结合赋予定向运转的功能 4.7固定化酶的应用 固定化酶的显著特点： (1)酶的稳定性增加。 (2)酶经固定化后，可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值