端粒酶hTERT基因反义RNA表达载体构建及其对肝癌细胞SMMC-7721作用.doc

摘  要  端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的 DNA-蛋白质结构  具有维持染色体的结  构稳定和生物功能的作用. 随着细胞分裂端粒每次缩短 30 200 bp 当端粒缩短到某 临界长度时 细胞则发生衰老或凋亡 而许多肿瘤细胞由于某种机制的作用 激活了 端粒酶从而使端粒维持在一定长度 使癌细胞能够持续繁殖 端粒酶是一种核糖蛋白  酶  端粒酶催化亚基具有逆转录酶活性  能以自身 RNA 为模板  向染色体末端添加  端粒序列  弥补端粒的丢失阻止端粒缩短  据统计  大部分恶化肿瘤中端粒酶检测为阳性,由于端粒酶活性和肿瘤细胞的生  存与转化间存在如此高的相关性 人们认为两者之间必然有某种联系 端粒酶激活可 能是细胞癌变或永生化的一个必然通路 因此抑制端粒酶活性可作为肿瘤基因治疗的 一个理想的新靶点 本文以分子克隆技术成功构建人端粒逆转录酶(hTERT)基因反义 RNA 表达载体 研究其对肝癌细胞 SMMC-7721 生长的影响 采用聚合酶链反应 PCR 扩增 hTERT  基因片段  经测序证实后  反向插入到表达载体 pcDNA3.1/myc-His 中  成功构建  hTERT 基因反义表达载体 pcDNA3.1-hTERT(as)  经脂质体介导转染人肝癌细胞株  SMMC-7721,通过新霉素类似物(G418)筛选获得表达端粒酶 hTERT 基因反义 RNA  的稳定细胞株  采用噻唑蓝  MTT  法  端粒重复序列扩增-酶连免疫吸附检测法  TRAP-ELISA  流式细胞术和荧光定量 PCR 仪分别观察细胞的增殖  端粒酶的活  性和细胞凋亡及细胞 hTERT 基因 mRNA 的水平  结果发现  1.  通过细胞生长曲线的绘制和 MTT 法研究端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 对肝  癌细胞 SMMC-7721 生长的影响  结果表明  与对照组细胞相比  hTERT  基因反义 RNA 能明显抑制肝癌细胞生长  2.  通过 TRAP-ELISA 法研究端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 对肝癌细胞端粒酶  活性的影响  hTERT 反义 RNA 转入肝癌细胞 SMMC-7721 后  与对照组相  比 细胞端粒酶活性明显降低  3.  通过流式细胞仪研究端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 对肝癌细胞的凋亡和细 I 胞周期的影响 转染 hTERT 反义 RNA 的 SMMC- 7721 肝癌细胞在培养一段 时间后出现 DNA 亚二倍体凋亡峰 凋亡率为 13.77%,明显高于 SMMC-7721 肝癌细胞的 3.29%和转染空载体 pcDNA3.1 的 SMMC-7721 肝癌细胞的 3.37% 凋亡率显著提高 与对照组相比 转染 hTERT 反义 RNA 的 SMMC-  7721 肝癌细胞的细胞周期发生明显变化 其 S 期细胞数量明显增加 期细胞数量明显减少  G0/G1  4.  通过荧光定量 PCR 仪研究端粒酶 hTERT 基因反义 RNA 对肝癌细胞的  hTERT mRNA 水平的影响 与对照组相比 转染细胞的 hTERT mRNA 的水 平无变化 本研究表明 hTERT 基因反义 RNA 可有效抑制肝癌细胞生长和诱导细胞凋亡 为  反义 RNA 治疗肝癌提供了实验基础  为肝癌的基因治疗提供了一种新的方法  关键词  端粒  端粒酶  反义 RNA  肝癌细胞  II Abstract Telomeres are specialized ribonucleoprotein structures at the ends of eukaryotic linear chromosomes. They are composed of repetitive nucleotide sequences and associated proteins that protect chromosomes from degradation and recombination. They are essential for chromosome stability. In human somatic cells, telomeres shorten by 30 to 200 bp with each cell division. When telomeres were shortened to some threshold value, cell senescence or apoptosis was triggered. The mechanism is that telomerase