氨基酸和蛋白质剖析.ppt

* 由?肽组成 至少有：?l(I)/?l(II)/?l(III)/?1(IV)和?2胶原蛋白I：[?1(I)]2?2三螺旋 五种肽链AA顺序不同，分子量介于95000到100000之间，含1000个残基左右 5、胶原蛋白的类型 总目标：增加制品纯度 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶 六、蛋白质的分离纯化 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 盐析（（NH4）2SO4） 蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 凝胶过滤层析 蛋白质混合样 凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量 2、密度梯度（区带）离心 60000~80000转/分 重力60万～80万倍 3、凝胶过滤 离子交换层析 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 电泳 SDS电泳 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 等电聚焦电泳 等电聚集 双向电泳 * * * * Gly * * * 羊毛和真丝弹性比较 1978年从非洲爪蟾卵细胞和卵母细胞中分离出来,是爪蟾卵母细胞核中含量最丰富的蛋白,大约构成整个核蛋白的7%至10%，当时的描述是:一种酸性、热稳定性蛋白,在体外能促进纯化的组蛋白和DNA装配成核小体，现在知道哺乳动物细胞核中也存在。 * * * 二、多肽链在二级结构基础上进一步折叠形成蛋白质三级结构 蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，包括一级结构中相距甚远的肽段的空间位置关系。 （一）三级结构是指整条多肽链的空间分布 肌红蛋白 (Mb) myoglobin 153 AA 1 Heme A~H八段α-螺旋 无-S-S-键 功能：储存O2 (二) 维持三级结构稳定主要依靠非共价键 蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠弱的相互作用力或称非共价键、次级键，主要有氢键、范德华力（Van der Waals force）、疏水作用（hydrophobic interactin）和盐键（salting bond）（又称离子键）等。 a 纤连蛋白分子的结构域 （三）三级结构可含有功能各异的结构域 在二级结构或超二级结构的基础上，多肽链可形成在三级结构层次上的局部折叠区，称为结构域(domain)。 （四）根据结构域可对蛋白质进行分类： 根据结构域可将球状蛋白质分为4类： 反平行α螺旋结构域（全α-结构） 平行或混合型β折叠片结构域（α，β-结构） 反平行β折叠片结构域(全β-结构) 富含金属或二硫键结构域（不规则小蛋白质结构） A. 全α-结构域 B. 平行或混合型β折叠片结构域 C. 全β-结构域 D. 富含二硫键结构域 结构域 (domain) 3-磷酸甘油醛脱氢酶 NAD+ 3-磷酸甘油醛 （五）分子伴侣参与蛋白质的折叠 分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。 * 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。 * 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。 * 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。 目前已知参与蛋白质折叠的分子伴侣可分为3类： 热激蛋白70(Hsp70)：Hsp70在真核和原核生物中高度保守，它可部分逆转变性或聚集的蛋白质 。 伴侣蛋白(chaperonin)：伴侣蛋白普遍存在于细菌、线粒体、叶绿体和真核生物，主要有2个家族：Hsp60（在大肠杆菌中又称为GroEL）和Hsp10。 核质蛋白(nucleoplasmin) ：是一种主要的细胞核可溶性蛋白质,在真核生物的生殖细胞及体细胞中广泛存在,体外研究表明,它与核小体装配及受精后精子染色质的解聚及鱼精蛋白的替代有关。 伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用 各亚基间的结合力主要是氢键和离子键。 三、多亚基的蛋白质具有四级结构形式 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。 体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级