分子克隆技术--精品课程.ppt

操作步骤（一） 研钵处理：0.4N NaOH 浸泡过夜，DEPC水洗涤3遍； 液氮磨样，每管分装0.1克样品； 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离； 加200 μl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右； 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟； 将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟； 2-8 ℃ ，12000×g 离心15分钟； 弃上清，加1ml 75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500×g 离心5分钟，小心弃上清； 室温静置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 μl DEPC水溶解，保存于-70 ℃ 。 取2 μl 琼脂糖电泳检测RNA质量。 操作步骤（二） What are Total RNA like? Specific, Good, Contamination, Degradation Callus Leafs Degradation Contaminant RNA产量低的原因 样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底 RNA没有完全溶解 RNA降解的主要原因 取样后没有立即抽提RNA； 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70 ℃ ，而不是-20 ℃ ） 使用的溶液或器皿有RNase污染 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5 DNA污染的原因 样品太多，所加试剂相对太少 用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等 实验八 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：水稻幼嫩叶片RNA 实验原理： 目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 本实验以水稻叶片RNA为材料，检测β-actin基因的表达。实验中设定2个阴性对照：一个不加模板RNA，另一个不加反转录酶，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时以叶片DNA为阳性对照，检验PCR试剂和扩增过程是否有问题 操作步骤（一） RNA Preparation Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent. Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 ?g / ?l by DU640. . Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube: Total RNA 0.5-１?g RNase-free DNase ? １?l (１u / ?l) 10× DNase ? buffer 1 ?l DEPC-treated ddH2O 5 ?l Incubate at 37℃ for 15 min, then 70℃ for 10 min. 操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction Add 1 ?l 500 ?g / ml oligo (dT) 15 primer, mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Heat the mixture at 65℃ dry bath for 10 minutes, then place at room temperature for 10 minutes. Add the following contents: 5 × first strand buffer 4 ?l 0.1 M DTT 2 ?l 10 ?M dNTP 1 ? 操作步骤（二） Mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Place the tube at 37℃ w