分子生物学基因重组和基因工程.ppt

以大肠杆菌中的质粒载体为例： 大肠杆菌有一套自己的染色体，在染色体之外还有一环状DNA拿出来，因为它体积小，容易操作，通过人工改造变成载体。载体有几个重要部分： 1、用来复制的部分：克隆的话需要复制，要有调控的元件 2、人工改造的部分，用来筛选转到细胞是否成功。因为这一段的编码产物可以对抗抗菌素对宿主细胞的杀伤。如氨苄青霉素抗性基因，根据需要的不同选择不同的抗性基因。 3、装上Lac Z基因：乳糖操纵子，外界给了乳糖，可变成半乳糖，如果没有葡萄糖 Lac Z 如果成功转到大肠杆菌，就会产生 在含有 X-gal 、IPTG的培养基培养，B-半糖苷酶分解X-gal 的显色反应很灵敏。 B-半糖苷酶可以分解X-gal 变成蓝色，如果这个基因遭到破坏，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色， IPTG半乳糖的类似物，很有效地启动乳糖操纵子的基因转录。 对λ 噬菌体DNA中间部分进行改造，替换原来的结构基因，装上目的基因，利用它容易感染原核和真核细胞的性质，把目的基因带进去，其容量高，80－20Kb 病毒载体用的越来越多，因为病毒感染细胞的效率非常高（如，大肠杆菌载体效率不高）而病毒几乎百分之百。 病毒依靠表面的蛋白质与宿主细胞结合，去感染，把它的内容物释放到宿主细胞内。病毒基因组在两头有包装信号，中间是病毒的结构基因，第一步改造是把两头的结构信号拿掉，仅把结构基因重组，转到宿主细胞，能转成功的话，进入的全是结构基因与宿主的基因组整合，利用宿主的一切系统，把它的所有基因产物表达出来，在胞浆呆着，叫包装细胞；第二步，包装信号与目的基因重组，然后再与载体重组，转染到刚才已经建好的包装细胞中。包装信号是与目的基因连在一起的，利用宿主的基因组不断复制更多的带目的基因和包装信号的片段，这些片段当它与与已经有了的病毒蛋白相遇，包装信号发挥作用，可以包装成新的病毒（含有目基因但没有病毒的结构基因了），有感染力但无结构基因了。 有了基因有了载体，要想最终实现获得大量基因或产物，最终都要放到host cells实现。最常用的有3类：大肠杆菌、单细胞的真核生物（酵母B4）真核哺育类细胞。 拿基因根据目的不同，取的组织或细胞不同 就研究一个基因，而且知道这个基因组织中是表达的，表达量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑电泳，成功的 RNA是5.8S 18S 28S三个条带非常清楚，如果5.8S不清楚，凑合用，如果28S 18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA实验时要在一个独立的空间，所有东西都独立，不能与别的实验混合。得到的是总RNA，我们需要的是mRNA， mRNA尾巴上有polyA ，利用这个特别纯化，去掉tRNA、 rRNA，有了mRNA为模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相当稳定，可以长期保存下来。 有了cDNA，酶、引物、底物通过PCR技术，大量扩增。由于知道想做的这段基因的分子量，如果想知道这段基因的分子量，跑电泳，就可以大概知道拿到的这段基因是不是想要的基因，如果与理论基因分子量是对应的，那就可能是，最终的结论还需要测序。 如果是想要的基因，与载体重组，重组后转到细胞内，转到细胞有三种方法：化学的、物理的，生物的 。物理的方法比较简单有基因枪，电转；化学的方法，比如用Ca2+Cl2处理细胞，细胞表面的膜变得疏松，载体容易进入。质子体感染、病毒感染等都可以转入细胞 是否转进去，就开始筛。用抗生素先筛质粒是否转进去了，再用蓝白斑筛目的基因是否进去（蓝斑没有进去，白斑进去了） * * * * * 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 表达载体YEpI PT的物理图谱 名词解释 克隆 、 转化、 转导、 基因工程 、 转座 、 载体、限制性核酸内切酶类、 质粒、 G文库 、C 文库 1 、简述基因工程的基本过程序 2? 简述目的基因的主要来源可途径 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * (插入失活法) 抗药性标记选择 　　　如质粒pBR322,含有氨苄青霉素和四环素两种抗性基因，将目的基因插入到四环素抗性基因的位置，如果重组成功了，插入后转入受体菌进