第十四章 电泳分离技术.ppt

第十四章 电泳分离技术 一、电泳技术概述 1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。 20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。 60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。 电泳技术概述 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中必不可少的手段。 蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pH＜pI pH＝pI pH＞ pI 泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大小和形状有关。 被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F = E Q 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位降；Q为被分离物所带净电荷。 影响泳动度的因素 1．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同，电泳可分为两种。 (1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质等大分子物质。 (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。 影响泳动度的因素 2．溶液pH 溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。 对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。 影响泳动度的因素 3．溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在O.02～O.2之间。 影响泳动度的因素 4．电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。 如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动。 影响泳动度的因素 5．温度 电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活。 因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。 6．支持物 要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。 三、电泳的分类 ㈠、凝胶电泳 琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液；浓度常用1%-1.5%。 琼脂凝胶电泳的优点： 近似自由界面; 液固相间无明显界面，电泳速度快; 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定; 容易染色易洗脱. 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 Weintraub．L建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理 PAGE是根据被分离物质所带电荷的多少及其分子大小、形状不同，在电场作用下产生不同的移动速度而分离。它具有电泳和分子筛双重作用. 聚丙烯酰胺凝胶的优点 ①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； ②化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应； ③对pH和温度变化较稳定； ④几乎无电渗作用； ⑤样品不易扩散，其灵敏度可达10-6g； ⑥凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节； ⑦分辨率高； PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。 一些概念 凝胶浓度和交联度 不连续胶与连续胶 变性胶及非变性胶