产纤维素酶的筛选说课.pptVIP

10级毕业论文中期汇报 主讲人：何 园 学 号：2014103015 时 间：2014.11.13 1. 研究背景 2. 试验目的 3. 技术路线 4. 试验方法 5. 预期效果 6. 参考文献 讲解内容 一.研究背景 纤维素作为地球上最丰富的可再生有机资源，其转化和利用对解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。纤维素酶是能够作用于纤维素底物β-1,4葡萄糖苷键的一类生物酶的总称。由于开发利用木质纤维资源对人类社会的今后发展具有重大意义，而纤维素酶对纤维素资源的开发起到极为关键的作用，对其研究一直是国内外的热点。纤维素代谢也是地球生物圈碳素循环的重要组成部分，寻找和开发高产纤维素酶菌种，是充分利用纤维素资源的关键。 二.试验目的 目前，酸性纤维素酶主要用于纤维素的水解糖化，而碱性纤维素酶则广泛用于洗涤工业。不过，至今所研发的纤维素酶仍存在酶活力不足等问题，有必要挖掘新的酶资源。 三. 技术路线 产纤维素酶菌株的初筛 产纤维素酶菌株的复筛 菌株形态观察 菌株分子鉴定 诱变育种 产高活性纤维素酶菌株的鉴定 菌株生化鉴定 优化产酶菌株的培养条件 制备酶液 测定酶活力 绘制菌株生长曲线和产酶曲线图 测定CMC酶的最适作用条件 确定产纤维素酶菌株的属种 比较两种菌株酶活力 测其透明圈及酶活力 四.试验方法 1. 材料和仪器 (1).用于菌株分离的样品采自畜禽堆肥。 (2).所用培养基：LB培养基、CMC-刚果红平板筛选培 养基、CMC液体发酵培养基、Bug培养基 (3).仪器:菌种鉴定96孔板 2.方法 (1).菌株初筛：取样品1 g，加10 mL无菌蒸馏水，充分振摇，静止30 min，取上清液稀释105倍，涂布接种CMC-刚果红平板筛选培养基，30℃培养72 h至菌落长出，挑取透明水解圈较大的菌落。 (2).菌株复筛：挑取透明水解圈较大的菌落，接种CMC液体发酵培养基，37℃、200rpm摇瓶培养24 h，测定培养液的碱性CMC酶活力，选取活力最高的培养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基培养，纯化菌种３次，最后得到产碱性纤维素酶的高产菌株，命名，斜面和冷冻干燥保藏。 (3).菌株的形态观察：LB培养基培养的菌体用革兰氏染色，显微镜观察菌株形态。 (4).分子鉴定：提取菌体DNA(CTAB法)，以该基因组DNA为模板，采用通用引物27F/1492R，PCR扩增菌株的16SrRNA序列。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测、分离，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit 试剂盒切胶回收，用T4 ligase连接到Pmd-18T载体上。将带有目的片段的载体通过转化E.coli DH 5α菌株扩增培养后，选择阳性克隆提取质粒测序。将测序得到的16S rRNA序列用NCBI的BLAST2.0进行同源分析，搜索Genebank核酸数据库，根据比对结果对菌株进行分子鉴定。 (5).菌株生化鉴定:采用Biolog 微生物鉴定系统进行。操作按仪器的说明书进行。 (6).诱变育种： ●制备孢子悬液：取试管斜面，用无菌水洗下孢子，装入带玻璃珠的三角瓶中，27℃振荡2-3h，用脱脂棉过滤后，以10倍稀释法作一系列稀释，挑选一个稀释度，用移液管移l ml饱子悬液到小塑料离心管中，待用。 ●紫外(UV)诱变方法：距离紫外灯30cm左右照射60s、70s、80s、90s、100 s，并不断摇动。 ●硫酸二乙酯(DES)诱变方法:分别吸取1ml孢子悬液10ulDES(终浓度为1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料离心管中，于30℃水浴振荡45min、60min、75min，处理完毕后加入30ul 25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。 ● UV-硫酸二乙酯(DES)复合诱变 (7) .测定诱变后菌株的透明圈并将其菌株发酵测其酶活力。 (8).菌株生长及产酶特性测定:活化菌株接种CMC发酵培养基，接种量5％，30℃、200rpm下培养，定时取样测定培养液的OD600和CMC酶活力，观察菌株生长和产纤维素酶情况，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。优化菌株的培养条件，对3-12的pH值条件以及25-37℃温度条件下菌株生长也进行观察。 (9). 酶液制备:活化菌株接种CMC发酵培养基30℃、200 rpm培养48 h，取培养液，4℃，4000 rpm离心10 min，取上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4℃，10000 rpm离心10 min，收集沉淀，加入培养液同体积的pH值8.0，0.1 mol/L的Tris-HCL缓冲液溶解，４℃保存，用于测定酶的活力，2 d内使用。 (1