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淋巴细胞分离、E花环 微生物免疫教研室 实验目的 掌握密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞的的原理和方法。 掌握E花环测定原理和判定标准 熟悉E花环测定操作方法 实验原理 外周血淋巴细胞分离常用方法是聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法。PBMC与血液中的其他成分存在密度差异，利用密度在1.077±0.002之间，而且近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。 实验材料与试剂 ①肝素（100U/毫升）、D-Hanks液、 淋巴细胞分离液（ficoll）、瑞氏染液 ②离心机、显微镜、试管，吸管等。 实验方法与步骤 1、采集兔静脉血，注入盛有肝素（20U/ml）的搪瓷缸中，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。 2、每组用吸管吸取2ml抗凝血，加入等体积即2ml的室温D-Hanks液，使血液等倍稀释。 3、每组取已加入2ml淋巴细胞分离液的试管1支，将离心管倾斜45?角，在距分层液界面上1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管4ml，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。 4、2500转/分离心20min，离心后，管内可分为四层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为淋巴细胞层。 5、另取1只10ml试管，加入6ml D-Hanks液，用毛细吸管轻轻插到白膜层，取吸淋巴细胞层至此试管中，1500转/分离心10min洗涤，共2次。 6、弃上清，用1ml D-Hanks定容细胞，混匀。 7、用瑞氏染液染色，观察所分离细胞的形态和结构，并画图。 瑞氏染色 吸取淋巴细胞涂片，待涂片干燥后，滴加瑞氏染料3-5d，铺满玻片，0.5-1min后滴加等量的瑞氏染料缓冲液，用洗耳球吹匀，使染料混合均匀，5-10min后用流水冲洗，待干后镜检。 注意事项 1、将稀释血液加入Ficoll上时动作要轻，使界面清楚，避免与Ficoll混合。 2、操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。 3、细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一，最适密度在室温下应为1.077±0.002；应避光4℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用；使用中应避免细菌污染。 4、离心时的温度对分离效果亦有影响，温度过低，离心时间需适当延长，淋巴细胞丢失增多；温度过高，增加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞活性。离心时最适温度为18-25℃。 E花环实验（示教） 实验原理 正常人的T淋巴细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽相结合的受体（E受体），即CD2分子，是一种糖蛋白， 是T细胞所特有的表面标志，在体外一定条件下T细胞能直接与SRBC结合，形成玫瑰花样细胞团，称为E花环。此实验即为E玫瑰花环试验，常用于检测T细胞的数量、活性及分离T细胞。 实验材料 器材：离心机、显微镜、试管、玻片、毛细吸管、 试剂：详见实验教材P248 实验方法 1、分离得到淋巴细胞，计数后，用Hanks液配成1×107/ml细胞悬液。 2、取0.1ml淋巴细胞悬液，加入0.1ml 1%SRBC及20μl灭活小牛血清，混匀37℃静置5min，以低速500rpm离心5min，然后放入4℃冰箱2h或过夜。 3、取出试管，在细胞悬浮前，吸弃一半上清液，加入0.8%戊二醛溶液0.1ml，轻轻旋转混匀，置于4℃冰箱固定15min，制成湿片观察计数或制成干片，经瑞氏染色后镜检，此为Et花环，t代表细胞总数。 4、部分T细胞具有高度亲和力的SRBC受体，当SRBC与淋巴细胞按8:1混合，低速离心后不经低温放置，即能迅速形成E花环，称为Ea花环。 结果与分析 凡能结合三个以上SRBC者即为E花环阳性细胞，计数200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率，Et花环正常值60%-80%。 Ea花环正常值25%-40% 注意事项 1、试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4℃保存不超过10天。 2、绵羊红细胞和淋巴细胞的比例以16:1-50:1为宜。 3、E花环计数前，应轻轻悬浮，不能用滴管吹打，否则会使形成的花环脱落。 结果和讨论 记录实验结果，并绘制E花环阳性细胞图。 * * *