逆转录聚合酶链反应中的细节问题教材.pptVIP

PCR反应条件的优化 （一）PCR反应的缓冲溶液 提供合适的酸碱度和某些离子 10～50mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶 （二）镁离子浓度 Taq酶活性需要Mg2+ ， Mg2+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L 三）底物浓度 dNTP浓度在20～200 ?mol/L 四种dNTP必须浓度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性 （五）引物 引物浓度一般为0.1～ 0.5?mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95℃/30 ～60s 退火温度和时间 45～55℃/30 ～60s 延伸温度和时间 72℃ 60s 循环次数 25～30 不超过35 Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3‘ Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 3 4、引物同源性分析（用Blast进行同源性比较） 检查引物的特异性 3、Primer Premier 5.0设计的大鼠olig2引物 5、Blast进行同源性比较，确认引物的特异性后，联系公司，合成引物 6、引物的溶解和稀释 上下游引物干粉各加适量消毒双蒸水(灭菌注射用水)稀释至20μM, -20℃保存. PCR举例 注意：此PCR反应条件中缺预变性（94℃，5min)和最后的产物延伸（72 ℃，10min) DNA琼脂糖凝胶电泳 准备试剂： 1．电泳缓冲液：(TBE或TAE均可） (1)5×TBE: Tris 54 g Boric Acid 27.5 g 0.5mol／L EDTA 200 mL pH=8.0 定容至1000 ml。 (2)50xTAE????Tris? ? 242 g??冰醋酸? ? 57 mL??0.5mol／L EDTA 200 mL??pH 8.0 定容至1000 ml。 ? ?2．凝胶加样缓冲液(6×)??3．琼脂糖 4．溴化乙锭溶液(EB) 10mg／mL 5．DNA 分子量Marker 实验步骤 ⑴ 配胶（1﹪琼脂糖凝胶）0.3 g 琼脂糖加入30 ml 0.5×TBE中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60℃，加入3μl的EB，并摇匀. ⑵ 制胶：把梳子插入制胶槽相应位置，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，垂直向上拔出梳子，将凝胶连同胶槽置入电泳槽中，加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 (3) 点样：用移液抢吸取PCR产物5μl于塑料纸上，再加入1μl 的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 (4) 电泳：（由负极向正极电泳）打开电源开关，调节至合适电压(一般电场强度不要超过5V／cm )；可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约15min-30min。 (5)观察：关掉电源，将凝胶小心的从电泳槽中取出，置于紫外透射检测仪上观察，拍照，并分析。 * * * * 逆转录聚合酶链反应中的细节问题 RT-PCR原理 实验器具与材料 试剂 标本收集与保存 RNA抽提 逆转录反应(RT) 聚合酶链反应（PCR) 介绍内容 一、实验器具、材料 1、移液枪：1ml、200μl、20μl2、吸头及吸头盒：1ml、200μl、20μl （无菌无酶，可直接购买）3、EP管：1.5ml （无菌无酶，可直接购买） 4、PCR薄壁管 0.2ml 5、普通EP管：1.5ml、O.5ml（高压灭菌） 6、大瓷缸：2个 （180℃的高温干烤6h，灭活RNA酶，存放无酶EP管和PCR管） 7、组织捣碎棒（可直接购买） 1、DEPC水 500ml。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放4℃保存3、异丙醇4、氯仿5、电泳缓冲液(TAE/TBE)7、琼脂糖8、Taq酶（含MgCl2 Buffer）,-20℃ 9、dNTP ,-20℃ 10、随机引物,-20℃ 11、M-MLV逆转录酶 (Buffer) ,-20℃ 12、RNasin ,-20℃ 13、Trizol 100ml/1瓶 ,-4℃ 14、Marker, -20℃ 15、引物,-20℃ 二、试剂 三、标本收集与保存 1、细胞： 悬浮细胞：1500rpm,5min离心，取沉淀-80 ℃冻存，或直接抽RNA; 贴壁细胞：倒掉培养液，加Trizol 1ml,溶解细胞，直接抽RNA或冻存（如没有Trizol，可用胰酶消化后，同悬浮细胞处理） 2、组织： 液氮取材（越快越好），-80 ℃冻存：即可用于抽RNA,也可用于抽蛋白； RNA保护剂取材:用普通冰袋即可，但不宜用于抽蛋白； T