DNA酶切及电泳解说.ppt

电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常用方法。 该技术操作简便、快速，可以分辨用其他方法所无法分离的DNA片段。 直接用低浓度的荧光嵌入染料进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。 少至1-10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。 电泳后的DNA条带还可以从凝胶中回收，用于克隆操作。 Gel electrophoresis 琼脂糖水平凝胶电泳 Gel electrophoresis 聚丙烯酰胺垂直电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，其基本结构为： 现在琼脂糖已高度商品化，可以从商家购得高质量的琼脂糖凝胶。 Gel electrophoresis 电泳槽 电泳板、梳子（孔数） 电泳仪（恒压） 凝胶（可反复使用） 缓冲液 控制污染，注意安全 Gel electrophoresis 点样孔 核酸条带 Gel electrophoresis 1）DNA分子的大小。对于相同结构的DNA分子，一般来说，分子量越小，其电泳速度越快。分子越大，则磨擦阻力越大，就越难在凝胶空隙中蠕动，因而迁移得越慢。 2）DNA的构象。分子量相同的超螺旋环状、带切口环状及线状DNA通过凝胶时速度不一。 3）琼脂糖浓度。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。采用不同浓度的凝胶可分辨范围不同的DNA分子。 影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有： Gel electrophoresis 琼脂糖浓度（W/V） 线状DNA分子的有效分离范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有： Gel electrophoresis 4）所用电压。在低电压时，线状DNA分子的迁移速率与电压成正比。但是，随着电场强度的增加，高分子量DNA的迁移速率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。 5）碱基组成及电泳温度。 6）电泳缓冲液的组成。电泳缓冲液的组成及离子强度影响DNA的迁移率。有几种不同的缓冲液可用于天然双链DNA的电泳。这些缓冲液含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）、Tris-磷酸（TPE）。 影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有： Gel electrophoresis TAE: Tris , 冰乙酸 , EDTA TBE: Tris , 硼酸, EDTA TPE: Tris , 磷酸 , EDTA NEB: Tris , EDTA, NaAc Gel electrophoresis Gel electrophoresis 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中某一特定核酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 限制性核酸内切酶 它们主要是从原核生物中分离出来的； 是原核生物自我保护的一种机制； 它的发现为基因工程的建立奠定基础； 现已广泛应用于分子生物学实验及基因过程中。 限制性核酸内切酶 在分子生物学中的主要应用 ： 用于构建载体； 用于修饰外源基因； 用于检测DNA的质量； 用于RFLP、Southern分析； 用于质粒插入片段的分离检测。 限制性核酸内切酶 核酸内切酶都能够识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。 5 G-A-A-T-T-C 3 3 C-T-T-A-A-G 5 EcoR I切割位点 NNNG NNNCTTAA AATTCNNN GNNN ＋ 粘性末端 限制性核酸内切酶 核酸内切酶都能够