淀粉酶的离子交换层析实验.docVIP

实验1 淀粉酶的离子交换层析 摘要 采用离子交换树脂分离蛋白，掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。用层析柱、蠕动泵、自动部分收集器、紫外分光光度计等仪器洗脱蛋白质分子，成功分离纯化，得到洗脱曲线，得出穿透峰、洗脱峰1、洗脱峰2三个峰。 材料与设备 淀粉酶溶液、离子交换树脂、平衡缓冲液、洗脱缓冲液Ⅰ（含0.3M氯化钠的平衡缓冲液）、洗脱缓冲液Ⅱ（含0.5M氯化钠的平衡缓冲液）、蒸馏水、20*1cm层析柱、试管架、蠕动泵、自动部分收集器、紫外分光光度计、100ml烧杯*2、100ml量筒、 胶头滴管、1ml移液枪、玻璃棒。 实验步骤 装柱：取直径1cm，长度20cm的层析柱。将柱垂直安装于铁架上。自顶部注入处理好的树脂悬浮液，树脂沉降时，多余的液体从出口流出，不断缓慢添树脂悬浮液，至树脂沉降至15cm左右的高度即可。 平衡并调整流速：在层析柱中充满平衡缓冲液，将上端柱头旋紧，用大约20ml平衡缓冲液平衡树脂，同时将流速调整为2.0ml/min。 上样：打开柱子上端柱头，让柱内缓冲液流出，液面与树脂面相切，关闭出口；由柱上端仔细加入蛋白样品0.5ml，打开出口，让样品进入树脂，同时开始收集流出液；当柱内液面与树脂面相切时关闭出口；加入0.5ml平衡缓冲液，打开出口，待缓冲液面与树脂面相切时关闭出口，再加入0.5ml缓冲液，重复此步骤。缓慢添加平衡缓冲液直至顶端，旋好柱头。 洗脱：采用不断