3-1 细胞生物学研究方法.ppt

2.负染色（negative staining）技术 ●原理 又称阴性反差染色，借助染色剂的衬托，增加背景对电子的散射，使样品相对地透过较多的电子，最后在荧光屏上形成暗背景下的“亮像”。 此方法是Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用。利用高密度的重金属物质作染色剂，把生物样品包绕，以增加背景对电子的散射作用，而生物样品与此形成电子密度差，在荧光屏上形成暗背景下的亮像，样品的精细结构的反差得以增强。这种技术具有分辨率高1.5nm左右、简单可行、快速等优点，在生物学研究中被广泛利用，特别在病毒学领域、生物大分子、细菌、原生动物，亚细胞碎片、分离的细胞器及蛋白质晶体的研究中发挥作用。 ●试剂制备 负染色最常用的染液是1~2%的磷钨酸水溶液（PTA）。 磷钨酸 2g 蒸馏水 100ml ●负染色技术步骤 1）样品分离与提纯 用离心、透析或滤膜过滤等方法分离，提纯样品。 2）制备悬浮液 将提纯样品用缓冲液制成适合浓度的悬浮液。 3）滴样 用细滴管将悬浮液滴在铜网上。 4）染色 用1~2%的磷钨酸水溶液染色1—2分钟。 3.冷冻蚀刻技术（freeze etching） ●基本原理 最早由Hall，G、E、（1950）首先提出，直到1957年才由Steere用于生物样品的制备。发展到今天，已经成为电子显微镜技术中一个独具特色的分支，并得到广泛的应用。 该技术是采用冷冻的方法使样品迅速固定硬化，然后在真空中切断，升温使冰升华，暴露出断面结构（蚀刻）。再在切面上喷镀一层铂—碳投影膜，形成复型膜，然后用消化液把样品本身消化掉，捞至钢网上在电镜下观察。 ●主要优点 a、样品不经过化学固定，脱水、包埋等有机试剂的作用和影响，减少细胞内物质的抽提，能更好地保存生物大分子的天然特性； b、由于断面通常是沿生物膜的结构薄弱处（膜的脂质层中间）劈开，故对于显示各类膜结构特别使用； c、分辨力强，反差较好； d、显示图象具有强烈的立体浮雕感； e、样品可常期保存。 其缺点是极易产生冰晶损伤，技术难度大，操作必须敏捷，一般不易掌握。 ● 主要仪器设备简介 真空喷镀仪 是电镜实验室具有的常规设备之一，是喷镀及复型技术所必须的一种仪器。该仪器主要有两部分组成，即真空系统和蒸发装置。世界上广泛应用的为日立公司生产的HUS——5型真空喷镀仪。 冷冻切断装置 包括刀座、样品座、支撑块、加温控制扎座、运载蓝。常用日立HFZ——1型。 冷冻蚀刻装置（加温控制器） 包括：加温控制器、保温瓶、加温控制插销、插座。作用在于断裂之后对样品进行加温，以便冰升华。 ●基本步骤 整个过程包括：样品固定→冷冻→断裂→蚀刻→复型→剥离→捞膜→观察。下面以动物材料为例，说明操作过程。（1）样品预处理 切成小条（长3 mm，宽1-1.5 mm）； （2）削制碳棒及烧制铂珠; （3）样品冷冻 a、断裂装置组装好，入液氮冷冻。b、将样品修整好装入样品杯的孔中，用自制小铝提勺入液氮中冷冻。冷冻结束后（停止沸腾）迅速将样品杯放入样品座的凹槽内，再一块入液氮。 （4）断裂 冷冻结束，迅速将提篮移到真空喷镀仪中开机抽真空，使真空度达到3×10-5托，此时温度约在-100—110℃。速板动拉杆使支撑块滑脱，刀座即下滑将样品切断。 （5）蚀刻 加温使其保持在-96—100℃，真空度在1×10-5~3×10-6托，断面上的冰即开始升华，持续约60秒左右。 （6）制作复型 首先以断面450角喷铂—碳，约需2—3秒。然后再以900角喷碳，以加固复型。每次1秒，间隔3—4秒，共喷4—5次。 （7）剥离 将样品小心取出放在次氯酸钠溶液中腐蚀。 （8）捞取观察 将复型膜小心捞至铜网上，染色后在TEM观察分析。 快速冷冻深度蚀刻技术 主要用于观察细胞骨架纤维及其结合蛋白 4.电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Stru