生物学综合性实验剖析.pptVIP

* 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)由丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。在凝胶聚合中，丙烯酰胺单体分子中的双键先打开，相互连接形成脂肪族长链分子，再由交联剂亚甲基双丙烯酰胺随机地与长链上的游离功能机团反应，构成三维网状结构的凝胶。 打开丙烯酰胺双键必需的自由基由引发剂过硫酸铵(APS)提供。凝胶聚合反应的催化剂为四乙基乙二胺 (TEMED)。 （3）灌制胶板将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。 4）凝胶制备过程中的注意事项 a) 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 b) 溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。c) 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。  5　凝胶电泳　　扩增反应结束后，热变性,低温冷却,每个DNA样品取2μl，在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，在常压、110W下，电泳2小时 预电泳（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。（本实验中采用常规的梳子，不必如此） （2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好