引物设计实例内部材料.pptVIP

引物设计实例分析 引物设计基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 阅读框 1. 引物的长度 一般为18-30bp，常用的是20bp左右，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度 2.扩增片段的长度 扩增片段长度在普通PCR以200～500为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。 3. 引物溶解温度（Tm值） 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G) 4. 引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高（非特异性扩增0或过低（扩增效率不高）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物自身 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败; 引物 3’端