原位杂交预案.pptVIP

Gall和Pardue于1969年建立。 １ 基因定位与基因图谱—遗传学２ 病毒学：最可靠，于组织细胞中直接  证明，病毒的存在。 EB HBV HPV３ 神经内分泌学：检查编码调节肽的mRNA,  确定激素的合成部位。４ 病理学：癌基因表达。 ５ 免疫学： Ag基因定位６ 发育生物学：基因的选择表达 原位杂交：mRNA （转录） 免疫组化：蛋白（翻译）７ 其他：细胞外基质蛋白的来源。 胶原基因表达，Ig起源细胞 1.基因组DNA探针：某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列，如病毒DNA等。 2.cDNA (complementary DNA)探针:最常用，以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 3.寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变。 4.RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。稳定性高、特异性强。 2）地高辛 Dig-dUTP---通过酶促反应掺入到DNA中去制成探针--杂交--加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色 灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物 (三)探针标记原理和方法 核酸探针标记发展史 1、体内标记 ：32P 2、体外标记：末端标记 缺口平移 随机引物 反转录标记 酶标记法 酶促反应 核苷酸 标记物 探针标记方法： 探针 化学标记法 带活性基团的标记物 化学反应 探针 1、探针的酶促标记法 1)、缺口翻译法 2)、单链DNA探针合成法 3)、寡核苷酸探针的末端标记法 4)、反义RNA探针的体外合成 5)、随机引物法 （1）缺口翻译法（nick translation） 限量DNase I在待标记的双链DNA的每一条链上产生若干个单链缺口。 利用E.coli DNA聚合酶I的5’-3’外切酶的活性和5‘-3’ 聚合酶的活性，在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口。 随着缺口在5’末端的移动，修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA链中。 双链DNA Dnase I 缺口翻译法 ? -32P-dNTP 32P标记的探针 DNA聚合酶I 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3‘ 3’ 5’ 带切口的双链DNA 变性 5‘ 3‘ 3’ 5’ 缺口翻译法的特点 （1）快速、简便、标记的探针均一、特异性高 （2）仅适用于较长的双链DNA （3）DNA聚合酶必须是大肠杆菌DNA聚合酶的全酶 （4）DNA酶I的浓度一定要适宜 （2）单链DNA探针合成法 通用引物与克隆了特异基因片段的M13噬菌体DNA杂交； 在? -32P-dNTP存在下，利用Klenow片段（仅具有5‘-3’多聚酶的活性，而无外切酶的活性）的链延伸反应合成高放射性的单链DNA探针； 适当的限制性内切酶切取所需探针序列； 变性胶电泳分离得到单链DNA探针。 M13噬菌体 插入片段 Klenow片段 通用引物 ? -32P- dNTP 热变性 纯化 限制性酶切 探针 单链DNA探针合成法 (3）末端标记法 T4多核苷酸激酶法（polynucleotide kinase)： 催化ATP分子上的? -磷酸基团与DNA5’-末端的磷酸基团进行交换。 末端脱氧核苷酸转移酶法： 催化dNTP在单链DNA3’-末端的多聚化。 OH3’ 5’P 3’HO P 5’ OH3’ HO 5’ 3’HO 5’ HO 碱性磷酸酶 5’P P 5’ OH3’ 3’HO 多核苷酸激酶 - ? -ATP T4多核苷酸激酶末端标记法法 （4）RNA探针体外转录 RNA聚合酶 SP6 RNA 载体 同义RNA探针：与mRNA同序列，做为对照探针 反义RNA探针：与mRNA互补，检测mRNA的表达水平 外源DNA ? -32P-dNTP （5）随机引物法（random　priming ) 随机引物按碱基互补的原则与模板DNA的相应区域结合。 DNA聚合酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA链。 反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针。 随机引物法的特点 （1）不但可用于双链DNA的标记，而且可用于 单链DNA和RNA的标记； （2）操作简单； （3）标记率高。 1、光敏生物素标记探针法： 注意事项：样品DNA要纯，不要含有蛋白；不要用Tris溶液溶解；双链DNA要先线性化；对大于200bp核酸片段标记效率高。 2、磺化核酸探针： 探针（cDNA或寡核苷酸）经磺化处理，再用针对探针上磺化基团的单克隆抗体进行免疫法检测。 2.化学标记法：