章基因功能研究基因打靶和转基因预案.ppt

【拓展知识】 思考1： Primer 2 NeoR Primer 1 Mouse genome 如何鉴定发生了同源重组的基因敲除ES细胞？ 提示： Each arm should be about 3 Kb. Shorter than 2 Kb might result in a reduced frequency of recombination. Homologous arm Homologous arm 方法1 ：PCR Determination of homologous recombinant ES cells (hybrid) 思考１： 如何鉴定发生了同源重组的基因敲除ES细胞？ 用什么方法可以鉴定转基因小鼠？ 要求： 明确转基因是否存在、 转基因整合到染色体的拷贝数 思考２： qPCR 考虑： 用EcoRI 酶切提取的转基因动物的基因组，但转进去的基因不会被切断。 如何解释上面的照片？ ? ? 用什么方法可以鉴定转基因小鼠？ 思考２： 方法： Southern blot 有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体。 问： 针对这类对于生长发育非常重要的基因，是否可以在已经形成个体的动物活体内进行knock –out ？ 该如何达到上述目的呢？ 思考3： 了解即可 条件性基因敲除 Conditional gene knockout 利用可诱导性启动子和Cre重组酶特异性识别位点构建基因敲除载体，通过诱导剂实现可控性基因敲除 两个要素： 诱导型启动子 Cre重组酶 Cre: 是一种蛋白质(从噬菌体P1提取获得) 名字来源于cause recombination 特异性识别DNA序列 (34bp)—LoxP (locus of crossing over in P1) 介导两个LoxP位点之间的特异性重组，从而删除两个LoxP位点间的序列 了解即可 1 2 3 4 LoxP LoxP Cre/LoxP重组系统： 鼠1的制备：待敲除基因位于两个LoxP位点 之间的基因敲除小鼠 TRE Cre Cre inducer ON Cre Cre Cre Tissue-specific 鼠2的制备：Cre 基因位于组织特异性、可诱导性启动子下游的转基因小鼠。 Cre/LoxP重组系统： 在这种小鼠的体内，Cre重组酶可在特定组织内进行可控性表达。 Cre/LoxP重组系统： 鼠2：Cre 基因位于组织特异性、可诱导性启动子下游的转基因小鼠 鼠1：待敲除基因的某个外显子位于两个LoxP位点之间的基因敲除小鼠 鼠3：待敲除基因位于两个LoxP位点之间的基因敲除小鼠 鼠3： TRE Cre Cre inducer ON Cre Cre Cre Tissue-specific 1 2 3 4 LoxP LoxP Cre Cre Cre Cre 1 2 3 LoxP 条件性基因剔除为什么可以在活体实现在特定组织、特定时期进行基因剔除？利用了什么基因表达调控知识？ 基因剔除是制造了一种基因缺失模型，但其实很多情况下基因在体内并没有缺失，而是因某种原因表达量低。 因此，基因剔除技术不能反映基因存在时的生理病理情况。 下节课：RNA Interference 思考4： 提问1：We have so many genes. 天书。We are eager to study their function. 研究基因功能的方法你认为可以是什么样的呢？ 我相信你一定见过或听说过可用于这方面研究的实例！ 学生讨论： 教师：事实上，很多由于基因缺陷而发生的遗传性病就是很好的人体模型！ 提问2：怎样把基因敲除呢？ 35 35 35 电话(L) Strategies for analyzing gene function 第三节 基因的生物学功能鉴定技术 姓名：王华 单位：吉林大学 白求恩医学院 分子生物学教研室 电话L) E-mail: wanghua1973@ —基因结构分析的基本策略 第二十二章 对题目的解析： 基因的功能 Protein DNA RNA Protein Gene mRNA 基本思路： 在DNA水平的技术 — 使相应基因缺失而失活: 基因敲除 — 细胞或动物获得新基因、或 额外拷贝的基因