限制性内切酶和引物介绍.pptVIP

引物设计的原则 引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15　　 引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 引物的内部稳定性 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。 引物设计软件 Primer Premier 5.0 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer Primer Premier 5.0使用介绍 Preimer Premier 启动界面 Load sequence Sequence name Original sequence Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好 Choose a function 引物设计界面 引物设计界面 First you can design the primer manually Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer 引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 搜索结果 28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer 引物编辑 引物编辑 编辑引物 分析引物结果 确认编辑的引物 * 一 ．限制性内切酶的分类：（三大类） I． I类， II类, III类. 2． I类，III类为限制---修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。 3 ． II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。 6、同裂酶（isoschizomer）识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC ， HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG ， MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外，Asp718Ⅰ 识别和切割位点为 G↓GTACC 。③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位点为