核酸大实验(上课).pptVIP

核酸大实验 ----生化三组 实验一.动物肝细胞内DNA和RNA的提取和分离 实验二. 地衣酚法测定RNA含量 实验三.二苯胺法测量肝组织中DNA的含量 实验一.动物肝细胞内DNA和RNA 的提取和分离 实验目的：初步掌握从组织中分离和提纯DNA与 RNA的原理和方法。 实验原理： 核酸的常用方法是STS法：首先使细胞破碎，使核酸处于易提取的状态。其次除去组织中存在的酸溶性物质，脂类及蛋白质等物质，因为它们可干扰RNA和DNA的测定。然后根据碱水解RNA而不水解DNA的特性，可将RNA水解产物与DNA分开，再分别测定RNA和DNA的含量。 仪器： 研钵、剪刀、各式试管、离心管； 离心机、三用恒温水浴箱，手术器械。 试剂： 柠檬酸钠、20%三氯醋酸（TCA）、10%TCA、无水乙醇、氯仿-甲醇（体积比2：1）混合液、乙醚、0.3N氢氧化钾、6N盐酸、0.1N盐酸、5%高氯酸溶液 仪器与试剂： 具体操作流程： 抗凝血剂 可提高RNA提取量 使蛋白质变性 沉淀蛋白质 除去残余的TCA与柠檬酸钠 均为脂质的良好溶剂 研磨好的鸡肝匀浆 加入氯仿甲醇后 沉淀在清液上方 加入氯仿甲醇后 沉淀在清液下方 蒸干乙醚后所得粉末 加入KOH后研磨成糊状 操作注意事项： 1.研磨鸡肝时先加1mL柠檬酸钠，基本成浆后再加 3mL柠檬酸钠比直接加4mL柠檬酸钠更利于研磨。 2.除脂质时应先加1mL蒸馏水并立即搅匀，加入无 水乙醇后再搅拌，固体容会结成块状，难以搅开。 3.加入氯仿甲醇后的沉淀与清液不易分离，可以用 一张滤纸挡在离心管口，让清液顺滤纸流下，从而达到分离的目的。 4.离心机使用时务必保持平衡，否则会引起各种事故与机器的损坏。 实验二. 地衣酚法测定RNA含量 实验目的：掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。 实验原理： 核酸在碱性条件下水解为碱基、五碳糖和磷酸，这三个组分在核酸分子中等比例存在，故测定其中任一组分均可计算出核酸的量。酸性条件下RNA中的核糖脱水环化成糠醛，地衣酚(3，5二羟基酚)可与其作用呈绿色，在670nm处有最大吸收，用分光光度计测得反应液OD值从而可知样品中RNA的含量。 仪器与试剂： 仪器：试管、分光光度计、比色皿、水浴锅 试剂： RNA待测液、RNA标准液、6N盐酸、地衣酚 具体操作： 每克肝组 织中RNA含量： RNA（mg/g组织）=O.D待测/O.D标准×0.1×1/0.05×5 =O.D待测/O.D标准×10 加入地衣酚，准备进行水浴加热 水浴加热后，含RNA的管中出现绿色 注意事项： 1.沸水浴15分钟的时间掌握一定要准确。 2.试管从水浴中取出后应尽早测量OD值， 放置时间过长会导致OD值的改变。 3.可用冷水冷却试管，但不要用冰水冷 却，过冷会导致OD值的改变。 实验三.二苯胺法测量肝组织中DNA的含量 实验目的： 掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法 实验原理： 核酸在碱性条件下水解为碱基、五碳糖和磷酸，这三个组分在核酸分子中等比例存在，故测定其中任一组分均可计算出核酸的量。DNA中的脱氧核糖在酸性条件下脱水生成w-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺反应生成蓝色物质，在595nm有最大吸收峰。 仪器与试剂： 仪器： 各种试管，分光光度计、比色皿、水浴锅 试剂： DNA待测液、DNA标准液 蒸馏水、20%高氯酸、二苯胺 具体操作： 每克肝组织中DNA含量： DNA（μg/g组织）=O.D待测/O.D标准×200×5 =O.D待测/O.D标准×1000 水浴加热后的DNA反应液，呈蓝色 从左至右依次是：标准管、待测管、空白管 1.加样时一定要按表格上的顺序先加高氯酸再加 二苯胺，不然会出现白色沉淀，影响后续实验。 2.试管从水浴中取出后应尽早测量OD值，放置时 间过长会导致OD值的改变。 3.可用冷水冷却试管，但不要用冰水冷却，过冷 会导致OD值的改变。 注意事项: