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第九章 电泳和电色谱 electrophoresis and electrochromatography 概 述 ?电泳(Electrophoresis) 荷电溶质(电解质)或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象，简称EP 。 ?电泳分离 利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。 ?电泳与色谱技术的比较 共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离 　不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。 色谱为浓差驱动的传质平衡分离法 电泳是外力(电场力）作用下的差速分离法 ?电泳与色谱技术的结合　　 －－－－－电色谱 电泳色谱:将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技术 电色谱：利用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定相和流动相的分配行为差异进行分离 　 一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱 ?电泳法的发展 20世纪初期 已用于蛋白质的分离 70年代前，主要应用于分析目的 70年代后，分离制备规模 90年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和微量分离制备 ?电泳技术的分类 　? 根据原理和操作形式可分为： 区带电泳 等电点电泳 等速电泳 ? 根据是否使用凝胶载体可分为： 凝胶电泳(Gel electrophoresis) 自由流电泳(Freeflow electrophoresis) ? 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为: (1)板式电泳： 水平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。 垂直板式电泳：支持物垂直放置　 (2)柱式电泳： 　采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，回收组份，多用于制备 ?电泳的应用： 1、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等 2、分析某种物质的纯度及分子量 第一节 基础理论 ? 常用的凝胶载体 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖、淀粉（易发生电渗流，造成分离度下降） 三、电渗流速度 (1) 样品性质：带电量，分子大小，形状 分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快 (2) 电场强度：电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快 　过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽，蛋白变性。 　过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置 (3) 缓冲液的性质 a 缓冲液的pH pH 决定带电量，(pH-PI)越大，带电量越多，迁移速率越大 b 离子强度 I越大，样品电流减小，迁移率变小；I越小，样品电流越大，迁移率越大，但样品易扩散，一般I在0.02-0.2M 第二节 凝胶电泳 利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。 相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，而小分子溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。是区带电泳分离法 ?凝胶电泳与凝胶过滤的区别： 凝胶电泳：样品中各分子的运动速度是小分子快于大分子 凝胶过滤：大分子运动快于小分子 　原因：凝胶电泳中,系统里没有空隙体积,只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。 1.板式凝胶电泳 处理量很小，不适合生物产物的分离制备。 2.圆柱型凝胶柱 凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。 缺点：操作过于繁琐，回收率不高，且易变性 　　　－－－根据溶质的相对分子质量选择 ?7.5％的聚丙烯酰胺凝胶 　孔径较小，适用于相对分子质量为10kD～1000kD的溶质的分级分离； ?3.5％的聚丙烯酰胺凝胶 　孔径较大，适用于相对分子质量为1000kD -5000kD的溶质的分级分离 ?聚丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂糖凝胶 　孔径更大，适用于分离相对分子质量更大的溶质。 　核酸的分离通常采用0.5％-1％的琼脂糖凝胶 由浓度不同的两层凝胶组成:浓缩层和分离层 ?上层凝胶：浓缩层 凝胶浓度较低(丙烯酰胺浓度为2％～3％Tg)，孔径较大，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质以等速电泳的形式泳动，得到浓缩。 ?下层凝胶：分离层 凝胶浓度较高(5％～25％Tg)，各个组分根据迁移率的差别得到分离。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所