第三章动物细胞融合与杂交讲述.ppt

第三章 动物细胞融合与杂交 一、细胞融合和杂交概述 二、细胞融合方法 三、融合子的检出与鉴定 四、杂交瘤技术 第一节 细胞融合与杂交概述 一.概念和目的 细胞融合：自然或人为条件下，两个或两个以上细胞相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合形成融合细胞的现象。 细胞杂交：不同类型的细胞之间发生的融合叫做细胞杂交。（种间杂交、种内杂交） 目的：获得杂种优势 第二节 细胞融合的方法 一、细胞融合的一般过程 细胞融合过程可分为： 凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关 蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提 脂质分子重排：是实现细胞融合的关键 胞质合并：后续的稳定步骤。 二．融合方法 最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。 灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。 使用仙台病毒诱导细胞融合步骤 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液，置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集 温度升至37℃ ，间歇摇动30分钟，使其进行融合 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性培养基进行培养。 2．化学诱导融合 它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中则以PEG的使用最为广泛。 PEG可能的促融合作用机理 1、PEG可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。 2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。 3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。 PEG诱导细胞融合的效果： PEG分子量大小:1000－6000 浓度:30－60％。 PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细胞毒性和粘度也随之增大。一般认为PEC浓度为30－50％时，以分子量1000的融合效果最佳。如果浓度增至50％和60％时则改变PEG400为好。 PEG的处理时间。悬浮法，1－2分钟 离心法，5－8分钟 若辅以5－15％的二甲亚砜或在融合前先用植物血凝素处理一下，则效果更好。 PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操作简单，诱导率也相对于病毒诱导要高。使目前最常用的细胞融合诱导方法。 3．电融合法： 电融合技术的原理： 悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm 的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。 电融合技术的优点 ①对细胞损伤小。 ②融合效率高。 ③融合方法快速，可重复性强。 ④融合细胞可在光镜下直接观察、跟踪、鉴定，可控性好。 最大的不利之处是仪器的购置。 在融合大小不同的细胞时存在问题。 在融合膜成分不同的细胞时存在困难。 电融合技术的改进方法 1、物理法 磁-电融合法 声-电融合法 电-机融合法 2、化学法 利用化学试剂（刀豆蛋白A等）凝集细胞后电融合。 3、特异性电融合法 利用抗原抗体特异性结合凝集细胞电击。 三、细胞融合的影响因素 1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面性质、亲本细胞的亲缘关系） 2.融合条件（温度、pH值、氧气） 3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50—100mmol/L） 第三节 融合子的检出与鉴定 一、融合子的筛选 遗传互补筛选法：HAT筛选 营养缺陷型互补选择法 抗性互补选择法 形态特征选择法 生长特性选择法 二、融合子的鉴定 1.细胞学鉴定：染色体鉴定 2.生化分析：同工酶谱分析 3.分子生物学鉴定：DNA探针技术 第四节 杂交瘤技术 一、基础知识： 抗体：免疫球蛋白 抗原：可诱导机体产生免疫应答，并可与应答产物结合的外来“异物”。 免疫反应：指机体免疫系统对异己物质的识别与清除等一系列复杂过程。 抗体分子组成：2 Fab + 1 Fc 单抗：单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。（均一性、特异性） 二.B淋巴细胞杂交瘤技术 基本原理：正常的可产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交的细胞在